随着外科技术日益发展,接受手术治疗的婴幼儿、儿童、孕妇也在增加。导致对麻醉药物副作用的关注增加,尤其是对未成熟大脑的影响。麻醉药物可以通过兴奋了-氨基丁酸受体(Gamma-aminobutyric acid,GABA)或者抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartat,NMDA)产生麻醉作用,但研究发现麻醉药物对于发育期神经元具有毒性作用,可能导致神经元细胞凋亡,损伤大脑。基于啮齿动物的研究表明,与目前使用的大多麻醉药一样,影响NMDA和GABA受体的药物会引起发育中的大脑神经元凋亡和神经退行性病变。大多数临床前研究集中在诱导神经元凋亡和随后的认知障碍所需的麻醉给药时间和剂量。但神经细胞凋亡和长期神经元密度之间的关系却很少有人关注。在有些研究中并未观察到神经细胞凋亡与长期认知障碍之间的关系,有可能是麻醉药物浓度低或者单次麻醉暴露引起的。如果较低的麻醉剂量或者单次麻醉暴露只能引起神经元减少但没有导致长期的学习认知障碍,说明神经细胞凋亡可能不是认知障碍的直接原因。未来研究中应该多关注其他影响神经细胞凋亡的可能机制。异丙酚自1989年开始用于麻醉诱导和维持,由于具有快速起效的特点,并且停药后迅速恢复,成为诱导和维持全身麻醉极其有用的药物。异丙酚的麻醉作用主要是激活GABA A型受体介导的,同时对NMDA受体也会在一定程度上进行抑制。在神经系统的发育过程中,这两种受体具有重要的作用,很多重要的生理过程都需要它们的参与。这两种受体的兴奋和抑制间的平衡会影响神经元的存活或凋亡。神经系统发育过程中对外界的干扰会很敏感,从而会对长期的认知功能产生影响。与其他常用的麻醉药比较,异丙酚副反应较小。但最近较多的研究结果表明,在体内和体外模型中异丙酚都可以诱发神经毒性。研究表明,异丙酚单独麻醉或与其他药物联合使用,诱导了实验动物大脑中神经元死亡,导致随后的学习和记忆障碍。神经发生期间有很多发育事件,异丙酚可能在特定阶段影响神经元。研究报道异丙酚会引起轴突回缩和树突生长减少。还有研究发现异丙酚除了诱导神经细胞凋亡以外,亚麻醉剂量的异丙酚可以抑制7-9日龄小鼠新神经元的增殖,另外神经元的形态学成熟延迟。异丙酚可能参与了改变多种细胞过程。尽管许多研究发现异丙酚在发育期动物脑中诱发神经毒性,但具体的机制还不是很清楚,也有报道称影响神经干细胞存活及神经发生、线粒体损伤、钙信号异常、MicroRNAs介导的机制、BDNF失调、炎症因子等多种机制都可能参与了异丙酚的神经毒性作用,但都还需要进一步的研究。右美托咪定是一种高选择性的α2受体激动剂,具有镇静、镇痛、抗焦虑作用,这些作用具有剂量依赖性,同时还具有交感抑制活性、无呼吸抑制等药理特性。由于这些优点,右美托咪定已经在临床得到广泛应用。手术麻醉以及手术之后的镇痛和镇静都可以使用右美托咪定。研究发现在神经、肾脏、心脏、肝脏、肺脏等多种器官损伤模型中右美托咪定都可以发挥保护作用,且多条信号通路参与了右美托咪定的保护作用。氯胺酮所致的神经元细胞凋亡可以被右美托咪定明显缓解。神经保护作用机制与抑制钙离子内流,谷氨酸清除,减少NMDA受体激活有关,也与脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经胶质细胞源性神经营养因子(Glialcell derived neurotrophic factor,GDNF)的高表达有关。离体实验发现异氟烷诱导了 caspase-3的表达,而右美托咪定则能够抑制这种作用,还可以逆转异氟烷导致的 Bcl-2(B-cell lymphoma-2)和 pERK(Protein kinase R-like endoplasmic reticulum protein kinase)蛋白的表达。75μg/kg 右美托咪定预处理出生 7 天 SD 大鼠,海马中磷酸化的 JNK(c-JunN-terminalkinase)、p38MAPK、NF-κB表达增加,可能MAPK(Mitogen-activated kinase)信号通路参与了保护作用。文献报道异丙酚能够诱导神经毒性,而右美托咪定则可以抵抗这种神经毒性产生保护作用,但是什么机制参与了这种作用还不清楚。本论文分离胎鼠的海马神经元,在体外进行培养鉴定,并研究右美托咪定对异丙酚所致神经毒性的保护作用的可能机制。目的:研究异丙酚是否诱导了体外培养的胎鼠海马神经元的凋亡,右美托咪定预处理对异丙酚诱导的神经元凋亡的影响,以及右美托咪定参与神经保护作用的可能机制,具体研究了以下问题:1.检测异丙酚处理对海马神经元活性的影响和右美托咪定预处理是否能够降低海马神经元凋亡。2.通过检测 Akt(Serine/threonine kinases)、p-Akt、Bad(Bcl-2/Bcl-XL-associated death promoter)、p-Bad 蛋白水平变化,探讨右美托咪定对降低异丙酚诱导的神经元凋亡的可能机制。3.通过LY294002抑制剂处理后,检测Akt、p-Akt、Bad、p-Bad蛋白水平,探讨PI3K/Akt信号通路是否参与了右美托咪定对异丙酚诱导神经元凋亡的保护作用。方法:1.培养和鉴定胎鼠海马神经元(1)根据专业人员建议,选取怀孕16-18dWistar大鼠,为了保证无菌,胎鼠大脑在超净工作台中取出,在解剖显微镜下观察处理,为保证纯度脑膜和血管等杂质尽要可能去除,操作过程在冰上进行可以神经元的存活率。用解剖剪将胎鼠海马组织剪成小碎块。(2)加入0.25%的胰蛋白酶37℃消化,中间摇动1-2次可以消化的 更充分,过滤除去未消化好的组织块得到单细胞悬液,重复消化一次。(3)混合两次消化得到的细胞悬液并计数,然后铺到6孔板(先用赖氨酸包被),培养液用含10%胎牛血清及2%B27的DMEM/F12培养基。培养4个小时更换为 96%Neurobal Medium+2%B27+100U/mL 青霉素+100μg/mL 链霉素+2mmol/mL L-谷氨酰胺培养基。(4)培养至第7天进行海马神经元鉴定,本研究采用神经元特异核蛋白(Neuron specific nucleoprotein,NeuN)抗体进行免疫细胞化学鉴定。2.试验分组随机分为7个组:(1)对照组(2)右美处理组(100μ M右美预处理)(3)100μM右美+异丙酚(100μM右美预处理30 min后加入100μM异丙酚处理3h)(4)10 μM右美+异丙酚(10 μM右美预处理30 min后加入100 μM异丙酚处理3h)(5)1μM右美+异丙酚(1μ M右美预处理30 min后加入100 μM异丙酚处理3h)(6)0.1 uM右美+异丙酚(0.1 μM右美预处理30 min后加入100 μM异丙酚处理3h)(7)异丙酚组(100 μM异丙酚处理3h)3.海马神经元细胞活性检测:不同浓度右美托咪定和异丙酚处理后的海马神经元,加入 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide),之后加入DMSO(Dimethyl Sulphoxide)溶解结晶,酶标仪检测细胞活性的变化。4.Akt、p-Akt、Bad、p-Bad蛋白水平检测:不同浓度右美托咪定和异丙酚处理后的海马神经元,获取细胞裂解物,测定蛋白浓度,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜后Western blot方法检测各蛋白水平变化。5.LY294002抑制剂处理后,检测不同实验组和对照组Akt、p-Akt、Bad、p-Bad蛋白水平变化。结果:1.神经元单细胞悬液进行台盼蓝染色发现,活细胞比率在90%以上。利用NeuN进行免疫细胞化学研究发现,海马神经元培养7天后神经元内可以观察到大量的棕色颗粒存在,说明成功获得了目的细胞,且90%以上为神经元,可以进行后续实验。2.通过MTT检测海马神经细胞活性发现,100μM异丙酚处理3h能够明显降低神经元的细胞活性(与对照组比较p<0.05),而100μM右美托咪定预处理则可以提高细胞活性,起到显著的保护作用(与1OOμM异丙酚处理组比较p<0.05),而低浓度的右美托咪定预处理(10μM、11μM和01μM)则对细胞活性没有明显影响。3.Western blot方法检测Akt、p-Akt、Bad、p-Bad和Bcl-xL蛋白表达变化,结果显示异丙酚处理能够明显降低p-Akt和p-Bad的表达水平,增加了Bad的表达,从而导致Bcl-xL/Bad的比率升高。100 μM/L右美托咪定预处理可以使异丙酚的这种效果逆转,升高p-Akt和p-Bad的表达水平,而10μM、1μM和01μM右美托咪定则对蛋白表达没有明显影响,说明PI3K/Akt途径可能参与了右美托咪定对神经元的保护作用。4.抑制剂LY294002处理后,p-Akt表达水平降低、Bad表达水平升高、Bcl-xL/Bad降低,说明LY294002对1000μ M/L右美托咪定的保护作用具有抑制作用。结论:1.成功培养获得了胎鼠海马神经元,存活率在90%以上。100μM/L异丙酚预处理能够降低胎鼠海马神经元的细胞活性,而l00μM/L右美托咪定可以起到保护作用。2.100 μ M/L异丙酚通过降低p-Akt和p-Bad的表达水平,增加Bad的表达诱导了海马神经元凋亡,100 μM/L右美托咪定可以逆转异丙酚诱导的神经元凋亡,起到保护作用,但10μM、1μM和01μM右美托咪定则没有明显的保护作用,说明右美托咪定的神经保护是有剂量依赖性的。3.100μM/L右美托咪定的保护作用可以被LY294002抑制,说明P13K/Akt信号通路参与了右美托咪定介导的保护作用。