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非生物胁迫尤其是盐胁迫对植物造成离子毒害、渗透胁迫和营养不平衡,使植物的生长发育受到抑制。液泡作为成熟植物细胞中最大的细胞器,在植物对逆境的适应和细胞生长发育的决策中具有重要作用。近年来,植物抗逆机理的研究开始集中在膜结构和酶活性方面。越来越多的研究表明,液泡膜上的两种质子泵—H+-ATPase和H+-PPase催化底物产生的电化学梯度,能够通过质子反向运输机制用于包括Na+在内的各种阳离子向液泡内的运输和积累,从而维持细胞中的离子平衡和细胞膨压,促进植物在盐胁迫下的正常生长。盐穗木( Halostachys caspica ),盐生旱生多汁半灌木。主要生长于盐碱地、沙地、河流及湖泊周围,在塔里木盆地及其周边荒漠地区分布较广泛。盐穗木嫩枝肉质,小叶鳞片状,这些形态上的构造使它增强抗旱耐盐能力,能够在盐土荒漠上生长良好,研究其分子水平的耐盐机理为利用盐穗木的基因资源改良作物性状,培育耐盐碱的经济作物具有重要的意义。本研究以实验室培养的盐穗木幼苗为试材,克隆获得其细胞液泡膜H+-PPase基因(HcVP1)开放阅读框,并将HcVP1基因和实验室已克隆完成的HcVHA-B基因(盐穗木液泡膜H+-ATPase B亚基)通过花序浸染法转化拟南芥,研究比较两种转基因植株的耐盐性初步阐明两个基因对植物耐盐性的贡献。主要结果如下:一、对盐穗木幼苗进行梯度盐胁迫处理(0,100,300,500mM NaCl)4d,提取不同处理的盐穗木总RNA,并进行半定量RT-PCR分析。结果显示,盐穗木液泡膜氢离子焦磷酸酶基因(HcVP1)和氢离子ATP酶基因(HcVHA-B)的转录水平随着NaCl浓度的提高而增强,明显受到盐分诱导,说明这两个基因与盐胁迫呈正相关性。二、根据已注册的HcVP1基因序列设计引物HcVP1 P1和HcVP1 P2,以盐穗木cDNA为模板进行PCR扩增,获得HcVP1的开放阅读框序列。将HcVP1和实验室已克隆获得的HcVHA-B基因构建到含有组成型启动子(CaMV 35S)的真核表达载体pCAMBIA1301上,并通过农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,经潮霉素抗性筛选分别获得8个HcVP1转基因株系和3个HcVHA-B转基因株系,并最终得到T3代转基因株系(HcVP1和HcVHA-B),由种子阳性率初步确定转基因拷贝数。基因组PCR和RT-PCR检测结果表明HcVP1和HcVHA-B基因已整合于转基因拟南芥的基因组中,并能够正常转录。三、检测转基因拟南芥和野生型拟南芥不同生长发育期的耐盐特性,发现盐胁迫下两种转基因植株(HcVP1和HcVHA-B)种子的萌发率明显高于野生型植株;在含盐培养上生长的两种转基因植株幼苗鲜重大于野生型植株,且随着盐浓度的升高差异显著;两种转基因植株成苗用200mM NaCl处理12d后长势正常,但经过相同处理的野生型植株却叶片萎黄、濒临死亡,且转基因植株的根系活力显著高于野生型(P<0.01);对其地上部分的Na+、K+含量测定结果显示,盐胁迫前后转基因植株均能积累更多的Na+、K+(P<0.01)四、转HcVP1基因的拟南芥在幼苗期耐盐性略低于转HcVHA-B基因的拟南芥,而成苗期转HcVP1基因的拟南芥耐盐性却明显高于转HcVHA-B基因的拟南芥。这暗示两种质子泵对植物不同发育时期的耐盐性的作用有差异。