论文部分内容阅读
生长素是植物生长和发育的重要调控因子,拟南芥侧根发育的各个过程都与生长素有着密切关系。生长素促进Aux/IAAs蛋白与SCFTIR1/AFB的结合,使得Aux/IAAs转录抑制子降解,释放出ARFs,调控下游基因的表达。拟南芥中,有23个ARFs成员,其MR结构域影响其转录激活和转录抑制活性。对拟南芥ARFs基因聚类分析,ARFX与具有转录抑制活性的ARFs聚类在一起,包括ARF1,ARF2,AR 和ARF11。目前,拟南芥ARF的功能研究还没有报道。本文利用CRISPR/Cas9技术获得ARFX突变体arfx-1和arfx-2。arfx突变体成熟植株和幼苗没有明显的可见表型。对其侧根的精细分析发现,尽管arfx突变体侧根总数和野生型对照类似,但该突变体侧根原基数目比野生型对照显著减少,而侧根的萌发却显著增加。同时,35S启动子驱动的ARFX过表达转基因植株及中柱鞘特异诱导ARFX表达都导致侧根密度显著降低,侧根萌发减少。原生质体瞬时转化实验证明ARFX是生长素抑制因子,相一致的,Pro35S:ARFX转基因植株中含有减弱的DR5rev:GFP信号,然而突变体arfx-1中DR5rev:GFP信号没有明显改变,暗示了 ARFX和其它ARFs功能冗余。酵母双杂交和BiFC实验证明ARFX与IAA28相互作用,QRT-PCR实验证明在生长素处理情况下,Pro35S:ARFX抑制侧根原基引发基因GATA23的表达。QRT-PCR和GUS染色实验表明ARFX与ARF7在转录水平上相互抑制,并且arfx/arf7双突变体能够部分恢复arf7突变体减少侧根萌发的表型,说明ARFX作为生长素抑制因子拮抗ARF7调控的侧根生长发育。对arf和arf7突变体表达谱分析发现,Qua-QuineStarch(QQS)基因是ARFX和ARF7共同调控的基因。在arfx突变体中,Qua-QuineStarch(QQS)基因上调表达,而arf7突变体中QQS表达下调。利用原生质体瞬时转化,酵母单杂和ChIP-PCR分析等实验,证明了 ARFX能够直接结合在QQS启动子区抑制其表达。12-K1染色实验和淀粉含量测定都显示,arfx突变体的叶和根中都有减少的淀粉和可溶性糖含量。我们的实验结果表明,高C/N比能够抑制侧根萌发。QQS RNAi植物内源具有高的C/N比,其侧根萌发和野生型对照比较明显减少。我们的遗传杂交分析表明,arfx-1/QQSRNAi能够回复arfx-1突变体中侧根萌发增加的表型。说明arfx突变体增加的侧根萌发是由于低C/N比造成的。Zhang Yu等人利用ChIP-seq和RNA-seq等分析推测,ARFX可能是PIF1,PIF3和PIF5的靶基因。我们也利用QRT-PCR分析检测到pifq(pif1/3/4/5)突变体中ARFX下调表达。相应的,在Pro35S:PIF1和Pro35S:PIF4中,ARFX转录表达明显高于野生型对照。原生质体瞬时转化,酵母单杂和ChIP-PCR等实验也都证明了PIFs能够直接结合到ARFX启动子区,调控其转录表达。研究还发现,ARFX转录表达明显受光的抑制,而且这一过程依赖于PIFs转录因子,并且主要发生在地上部分。利用D-Root装置,仅使植物根系生长在黑暗中,地上部分仍暴露于光下,没有检测到黑暗和光下生长的根中ARFX表达水平的变化。我们也检测到庇荫下ARFX基因上调表达,QQS表达量降低,与庇荫下PIFs蛋白积累相一致。在pifq,arfx和QQS RNAi突变体中,庇荫对侧根萌发的抑制作用明显减弱。同时,我们也检测到PIFs能够抑制QQS的表达,酵母单杂实验也发现PIF1能直接结合在QQS的启动子上。pifq突变体中也有减少的淀粉含量和增加的侧根萌发。在自然界中,庇荫环境下,光通过光受体感知后由PIFs介导信号转导,一方面诱导生长素响应抑制因子ARFX表达来抑制侧根萌发,另一方面ARFX与PIFs共同抑制QQS基因表达,使得植物体内处于高C/N比,减少侧根的萌发,来减少光合碳水化合物的消耗以更好的适应庇荫环境。综上所述,我们的研究结果表明,拟南芥生长素响应因子ARFX是生长素信号抑制因子,受PIFs转录因子正调控,并与PIFs共同抑制QQS表达,改变植物C/N比调控侧根萌发。同时,ARFX还通过抑制生长素信号,以拮抗生长素正调控因子ARF7的信号,参与侧根发育的调控。拟南芥ARFX调控因子将生长素,光信号和C/N比整合,共同调控侧根的生长发育。