论文部分内容阅读
地中海贫血(thalassemia)是一种遗传性慢性溶血性贫血,重型β-地中海贫血需要依靠长期输血和去铁治疗以维持生命。长期输血以及小肠上皮细胞对铁的吸收增加,可导致地中海贫血病人体内铁过载。铁过载引起肝脏、心脏、内分泌等多个器官功能衰竭,是地中海贫血患者死亡的主要原因,去铁治疗是重度β-地中海贫血治疗的重要组成部分。铁在人体内的可溶性极低(10-18 M),还原铁Fe++与过氧化氢反应生成的羟基自由基,在游离铁浓度过高时,高度反应活性的自由基能够破坏的DNA,脂质和蛋白质,可损害全身各组织器官,具有潜在的毒性,因此保持人体的铁稳态显得尤其重要。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA,最早在真核生物中发现,miRNAs具有内源性的特点,可调控多种生物功能。Micro RNAs也是调节铁稳态的调控因子之一,miRNA对铁代谢具有靶向调控作用。本课题从小肠是铁元素吸收的主要器官这一角度出发,通过构建铁过载动物模型,筛选出小肠上皮细胞铁代谢相关蛋白的差异表达miRNA,对mi RNA和靶基因的调控关系进行验证,在ICE-6细胞中的过表达mi RNA,研究该mi RNA调控IEC-6细胞的铁代谢功能。预计本研究可为铁代谢的miRNA调控、以及地中海贫血患者的去铁治疗提供研究思路和方向。第一章 铁过载小鼠模型的构建目的 构建铁过载小鼠模型,为下一步的研究提供合格实验标本方法 采用6-8周龄的KM雄性小鼠随机分为4组,腹腔注射不同剂量右旋糖酐铁,观察小鼠生长发育情况,每周称重并记录。造模结束后采集小肠、肝、脾、心脏、肾等组织及血清铁,测量铁元素,同时采集肝、脾、心脏、肾等组织制作HE和铁染色切片。结果 铁过载小鼠出现外观改变,生长发育落后。观察各组织器官可见形态颜色及质地改变,呈现明显的铁沉积,检测结果显示血清铁蛋白及小肠、肝、脾、心脏、肾等组织铁含量增加,程度和注射铁的剂量成正比。HE切片发现组织器官有病理改变,铁染色切片看见有不同程度的铁沉积,与注射铁的剂量成正比。结论 腹腔注射右旋糖酐铁可以构建符合后期实验要求的铁过载小鼠。第二章 铁过载小鼠小肠上皮细胞差异表达miRNA的筛选与验证研究一 铁过载小鼠小肠上皮细胞差异表达miRNA的筛选目的 比较正常对照组和高铁组小鼠小肠细胞的高通量小RNA测序结果,筛选出铁代谢相关基因的差异表达miRNA。方法 提取对照组和高铁组两组小鼠小肠上皮细胞的总RNA,构建RNA文库,选择合格文库进行高通量小RNA测序。评估测序质量、分析其特有序列,对测序数据进行基因组比对、miRNA的差异分析、差异表达miRNA的靶基因预测、GO富集分析、KEGG代谢通路分析,筛选出差异表达miRNA。对差异表达的miRNA采用Tagretscan等多个数据库进行交叉分析比较,筛选出可能靶向调控小肠铁代谢相关基因的miRNA。结果 共有正常组、对照组各3个文库进行测序,共筛选出9个差异表达miRNA,通过对这9个miRNA进行比较分析,最终选择miR-143,miR let-7d进行下一步的验证。结论 对两组标本进行小RNA高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析及靶基因预测,筛选出小鼠小肠细胞铁代谢相关miRNA。研究二 miR let-7d靶向调控Slc11a2基因及miR 143靶向调控Slc40a1基因的研究目的 探讨miR let-7d靶向调控Slc11a2基因及miR 143靶向调控Slc40a1基因的关系方法 分别构建Slc11a2基因和Slc40a1基因3’-UTR的野生型和突变型载体,同时合成mi R let-7d mimics和mi R 143 mimics,将mi RNA与构建好的报告基因载体共转染至293T细胞,通过检测报告基因相对荧光值的改变,以此验证该mi RNA和该靶基因的调控关系。结果 双荧光素酶的表达分析显示,mi R143对Slc40al基因野生型载体的荧光值没有下调作用。说明在该实验模型下,mi R143可能不能通过Slc40al基因上相应的3’UTR位点调控报告基因的表达。而mi R let-7d对Slc11a2野生型载体的荧光值有明显下调作用,下调差别有统计学意义(P<0.01)。说明在该实验模型下,mi R let-7d可以通过Slc11a2基因上相应的3’UTR位点调控报告基因的表达。结论 首次通过构建动物模型筛选出mi R let-7d,并证实其可以通过与Slc11a2基因上相应的3’UTR位点调控报告基因的表达,Slc11a2基因是miR let-7d的靶基因。miR143不能通过Slc40al基因上相应的3’UTR位点调控报告基因的表达,不能确定Slc40al是miR143的靶基因。第三章 miR let-7d靶向调控IEC-6细胞铁代谢功能的研究目的 研究在ICE-6细胞中过表达mi R let-7d是否能靶向调控Slc11a2基因的m RNA和蛋白表达,及调控ICE-6细胞对铁的吸收功能。方法 在IEC-6细胞中过表达miR let-7d,荧光显微镜观察IEC-6细胞的转染效率,采用Western Blot实验及q RT-PCR实验,检测转染后的Slc11a2蛋白表达量和扩增溶解曲线。使用含100mM的Fe SO4高铁DMEM-H培养基和普通DMEM-H培养基培养IEC-6细胞,并转染mi R let-7d mimics到细胞内,完成转染后收集细胞,对细胞进行计数后,原子吸收法测定细胞铁含量。另取培养板培养细胞进行铁染色,在倒置显微镜下观察细胞染色改变。结果 转染miR let-7d mimics后荧光显微镜下观察ICE-6细胞的转染效率在75%以上,说明mi R let-7d转染IEC-6细胞成功。过表达后的Western Blot结果显示空白对照组和处理组的蛋白表达量有明显区别,转染组的Slc11a2蛋白条带量减少。q RT-PCR检测Slc11a2基因mRNA的表达量,提示转染组mRNA的表达量下降,和空白对照组比较差异有统计学意义。结论 首次发现了miR let-7d可转染IEC-6细胞,miR let-7d通过靶向调控Slc11a2基因,抑制IEC-6细胞对铁的吸收。