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农业木质纤维素废弃物的生物转化是实现其资源化的重要途径,而生产纤维素酶和微生物蛋白是进行生物转化的两个重要方面。纤维素酶能将纤维素类物质降解为可发酵糖,在工业生产的各个领域具有广阔的应用前景；微生物蛋白的开发对于开拓饲料来源、提高饲料质量、解决粮食短缺等方面有着重要的意义。
本研究筛选得到一株产纤维素酶的菌株Aspergillus niger FL26,对其产纤维素酶发酵培养基及发酵条件进行了优化,并对纤维素酶进行了分离纯化及酶学特性的研究。在上述实验基础上,研究了混菌发酵联产纤维素酶和微生物蛋白的工艺。本研究所得结果如下:
(1)产纤维素酶菌株的筛选及鉴定:
从天然生境中筛选到一株同时高产内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的菌株FL26。通过菌落、菌株形态观察和rDNA ITS序列区段分析对该菌进行鉴定,得出该菌与黑曲霉亲缘关系最近,故命名为Aspergillus niger FL26。
(2)产酶发酵培养基及发酵条件优化:
通过单因子实验,确立最佳液体产酶发酵培养基的组成为:玉米芯2％,稻草秸秆1％,酵母粉2％,蔗糖1％,Mandels营养液(按比例加入)。最佳发酵条件为:培养基的起始pH为7.0,培养温度为30℃,250 mL摇瓶装液量为70 mL,摇床转速为160 r/min,发酵时间为144 h。在此最优发酵条件下得到的内切葡聚糖酶活力为306.67 U/mL,β-葡萄糖苷酶活力为174.98 U/mL。
(3)纤维素酶的分离纯化:
使用硫酸铵分级沉淀(50％～80％)、Sephadex G200凝胶层析和DEAE Sepharose FF离子交换层析对粗纤维素酶液进行分离纯化,可得到内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组分。经SDS-PAGE和Native-PAGE可确定内切葡聚糖酶的分子量约为30 kDa,β-葡萄糖苷酶的分子量约为130 kDa。
(4)纤维素酶的酶学性质:
内切葡聚糖酶的最适反应温度约为55℃；最适反应pH约为4.0；Mg2+、Fe2+对该酶有激活作用,Cu2+对该酶有抑制作用；乙醇浓度大于20％时该酶活性受到明显的抑制。β-葡萄糖苷酶的最适反应温度约为65℃；最适反应pH约为5.0,是具有一定热稳定的酸性酶；Mn2+、Co2+、Ca2+对该酶有激活作用,Cu2+对该酶有强烈的抑制作用；乙醇浓度大于30％时酶活力受到抑制。粗纤维素酶液降解未经化学预处理的水稻秸秆实验表明在6 h内糖化率可达26.4％。
(5)混菌发酵联产纤维素酶和微生物蛋白:
通过优选和驯化得到了一株高产微生物蛋白的菌株Candida utilis LW05。并初步确立混菌发酵的最佳工艺为:当菌株Aspergillus niger FL26产酶发酵进行至96 h时接入经活化的Candida utilis LW05,然后采取混菌共发酵48 h。在上述最佳混菌发酵条件下,采用半开放式生物反应器进行发酵放大试验,结果获得内切葡聚糖酶活力为202.74 U/mL,β-葡萄糖苷酶活力为191.43 U/mL。微生物蛋白产物经检测显示其粗蛋白含量高达37.14％;18种氨基酸种类齐全、含量丰富；黄曲霉素B1的含量为3.42μg/kg,远远小于国家标准要求的最低含量,是一种优质安全的蛋白饲料。