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携带有K88菌毛粘附素的产肠毒素大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是引起仔猪腹泻的主要流行致病菌株之一,FaeG是K88(F4)菌毛粘附素的主要蛋白亚基,具有粘附特性和良好的免疫原性,被认为是具有前景的疫苗抗原。L. lactis是公认的安全级微生物,具有佐剂性质,是诱导机体产生黏膜免疫的理想候选载体菌株。本研究采用L. lactis表达FaeG,期望口服免疫后,诱导仔猪产生特异性抗体,而达到抗仔猪腹泻的目的。表达FaeG的重组L. lactis构建：以ETEC C83907菌株质粒DNA为模板,通过PCR扩增FaeG基因,将其定向克隆到L. lactis细胞内表达载体pNZ8148和分泌表达载体pNZ8112中,转化宿主菌L. lactis NZ9000,构建了L. lactis NZ9000 (pNZ8148-faeG)和L.lactisNZ9000 (pNZ8112-faeG),经Nisin诱导后两个重组菌均表达FaeG,但L. lactis NZ9000 (pNZ8112-faeG)培养物上清液中未检测到目的蛋白,SDS-PAGE分析目的蛋白分子量大小约为27.0 kD,重组FaeG表达量分别约占菌体可溶性蛋白的10%和13%。Western blot分析显示重组FaeG具有良好的反应原性。小鼠动物模型检测重组L. lactis表达FaeG的免疫原性：试验选取6周龄、雌性BALB/c小鼠112只,随机分成14组。分别通过皮下注射和口服途径免疫小鼠重组L. lactis NZ9000 (pNZ8148-faeG)和L. lactis NZ9000 (pNZ8112-faeG)。结果显示,皮下免疫重组L. lactis NZ9000 (pNZ8148-faeG),诱导小鼠血清中产生特异性IgG,抗体滴度达11.32(10g2)；脾中产生IgG抗体分泌细胞(ASC)(817/107MC),表明皮下免疫重组菌诱导小鼠产生系统免疫反应。口服免疫小鼠L. lactis NZ9000 (pNZ8148-faeG),诱导小鼠血清中产生特异性IgG,抗体滴度达9.65(10g2),粪中产生特异性IgA,抗体滴度达6.32(10g2)；小鼠派伊尔结、脾和肠系膜淋巴结产生特异性IgA和IgG的ASC,表明口服免疫重组L. lactis诱导小鼠产生黏膜免疫反应和系统免疫反应。同时试验显示,提高重组L. lactis口服剂量及添加粘膜佐剂CTB可能是改善免疫反应的重要因素。通过口服和皮下途径免疫小鼠L. lactis NZ9000 (pNZ8112-faeG)诱导小鼠产生与L. lactis NZ9000(pNZ8148-faeG)相似的免疫反应。仔猪注射接种重组L. lactis,研究FaeG的免疫原性：试验选取6周龄仔猪28头,随机分成4组,皮下注射接种仔猪L. lactis NZ9000 (pNZ8148-faeG),结果显示,仔猪血清中产生特异性IgA、IgM和IgG,在初免后21、28、35和42 d,IgG抗体水平极显著高于载体对照组(P<0.01)；在初免后21和28 d,IgA抗体水平显著高于载体对照组(P<0.05)。重组L.lactis诱导仔猪空肠和回肠黏膜组织中产生了特异性IgA和IgM,抗体水平均高于对照组,但差异不显著(P>0.05)。免疫组化法检测组织中ASC,结果显示仔猪脾脏、十二指肠、空肠、回肠和肠系膜淋巴结中产生IgG、IgM和IgA ASC。说明注射免疫重组L. lactis,诱导仔猪产生系统免疫反应和一定水平的黏膜免疫反应。仔猪口服免疫重组L. lactis,研究FaeG的免疫原性：试验选择6周龄仔猪33头,随机分成5组,口服免疫仔猪L.lactis NZ9000 (pNZ8148-faeG),结果显示：仔猪血清中产生特异性IgG、IgM和IgA,在初免后28 dppi, IgG抗体水平极显著高于载体对照组(P<0.01),IgA抗体水平显著高于载体对照组(P<0.05)；另外,仔猪空肠黏膜组织中IgA抗体水平显著高于载体对照组(P<0.05)。免疫组化法检测脾脏和黏膜组织中ASC,显示仔猪脾脏、十二指肠中产生IgG和IgM ASC,而空肠、回肠和肠系膜淋巴结中产生了IgA、IgG和IgM ASC;空肠中IgM抗体IOD值显著高于载体对照组(P<0.05),表明口服免疫重组菌诱导仔猪产生黏膜免疫反应和系统免疫反应。本研究提出致仔猪大肠杆菌性腹泻ETEC黏附素FaeG在L. lactis中重组的创新思路,成功构建细胞内表达和分泌表达FaeG的重组L. lactis,小鼠和仔猪免疫试验表明了重组FaeG具有良好的免疫原性。首次采用仔猪作为试验动物评价重组L. lactis免疫效果,为以L. lactis作为抗原递送载体,预防大肠杆菌性腹泻的基因工程制剂的研究奠定了基础,为生猪健康养殖展示了新的技术途径。