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目的:
(1)观察四个特异性TIMP-1小干扰RNA质粒转染HSC-T6细胞后对TIMP-1表达的抑制情况,并筛选出沉默靶基因TIMP-1效果最强的一个干扰质粒。
(2)探讨同时阻断MMPs-TIMPs系统和TGF-β/Smad7信号通路,是否比单一阻断其中一条通路抗纤维化作用更强。
方法:
1.质粒抽提、HSC-T6鉴定及质粒转染HSC-T6效率的检测:通过电泳及测序对抽提的TIMP-1siRNA(包含TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA3、TIMP-1 shRNA4、TIMP-1 shRNANON)、Smad7、反义TIMP-1重组质粒进行鉴定;运用荧光免疫技术检测HSC-T6细胞α-SMA蛋白的表达;质粒在脂质体介导下瞬时转染HSC-T6细胞48h后,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测质粒转染效率,明确转染效率最高的质粒与脂质体比例。
2.高效沉默TIMP-1的小干扰RNA表达质粒的筛选:采用转染效率最高的质粒与脂质体比例,将TIMP-1siRNA转染HSC-T6,经过G418筛选获得稳定表达HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR (real-time PCR)方法检测TIMP-1mRNA的表达,筛选出沉默靶基因TIMP-1效果最强的一个干扰质粒。
3.TIMP-1小干扰RNA、Smad7及反义TIMP-1重组质粒联合作用对HSC的影响:将筛选出的沉默TIMP-1效果最强的干扰质粒与Smad7质粒联合转染HSC-T6细胞,并与单独转染TIMP-1shRNA、Smad7、反义TIMP-1质粒组进行对比,通过real-time PCR技术检测以上各组TIMP-1、Smad7及a-SMA mRNA的表达,激光共聚焦定量分析a-SMA荧光强度的变化,观察联合转染组和单一转染组对HSC的影响。
结果:
1.经电泳及测序证实TIMP-1小干扰RNA、Smad7及反义TIMP-1重组质粒抽提成功;HSC-T6细胞荧光免疫结果显示:α-SMA蛋白表达阳性,阳性部位在胞浆,表明HSC-T6为表型活化的HSC;质粒转染细胞48h后,激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测结果显示:当质粒、脂质体比例(DNA/LIPO)为2μg/8μL时,转染效率最高,可达37%。
2.实时荧光定量PCR结果显示:TIMP-1四个特异性的小干扰RNA质粒中,TIMP-1 shRNA1、TIMP-1 shRNA2、TIMP-1 shRNA4对TIMP-1基因表达有较强的抑制作用,其中TIMP-1 shRNA1沉默靶基因效果最强。
3、TIMP-1 shRNA1、Smad7、及反义TIMP-1质粒联合转染后,与对照组相比,联合TIMP-1shRNA1+Smad7组、TIMP-1 shRNA1组、Smad7组、反义TIMP-1组这四组中的TIMP-1、a-SMA mRNA表达水平显著下调,Smad7mRNA表达水平显著上调,尤TIMP-1 shRNA1+ Smad7联合组最为明显(P<0.01);激光共聚焦检测a-SMA蛋白水平变化与其转录水平的变化趋势一致。
结论:
1.α-SMA表达阳性是鉴定HSC活化的重要指标。
2.对于同一种细胞,质粒与脂质体比例不同,转染效率亦不同;激光共聚焦显微镜结合流式细胞仪可以快速、高效检测细胞转染效率。
3.TIMP-1小干扰RNA可以高效沉默靶基因的表达,特异性小干扰RNA序列不同,沉默靶基因的效率亦不同。
4.TIMP-1 siRNA、Smad7、反义TIMP-1重组质粒均能下调HSC激活信号,抑制ECM的合成,在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性。
5.同时阻断MMPs-TIMPs系统和TGF-β/Smad7信号通路,比单独阻断其中一条通路抗纤维化效果更强,TIMP-1 shRNA1联合Smad7有望成为治疗肝纤维化的手段。