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背景与目的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉及其它肉制品所致。目前,旋毛虫病在俄罗斯及东欧国家、墨西哥、智利、阿根廷和泰国等地仍严重流行。我国云南、西藏、四川、广西、湖北、河南、山西、北京、辽宁、吉林、黑龙江等地先后爆发数百起旋毛虫病,估计目前全国感染人数超过2000万。人感染旋毛虫后可能出现的症状主要有恶心,呕吐,乏力,低热,腹痛,腹泻或便秘等,严重患者可伴有持续性高热,眼睑和面部水肿,全身性肌痛,心肌炎,肺炎或脑炎等。microRNA（miRNA）是一类长约1924 nt的内源性非编码RNA,通过与靶mRNA的特异性结合,可导致其降解或翻译抑制。miRNA在多种寄生虫不同发育时期的表达具有特异性,如血吸虫的sja-mi R-1、sja-miR-7-5p与幼虫性成熟有关,sja-miR-36-3p与童虫的初期发育相关;分析显示一些miRNA还参与了与发病机理相关的信号通路,如广州管圆线虫的miR-146a-5p、miR-132a-3p可能参与了广州管圆线虫感染引起中枢神经系统炎症的相关基因调控。现今与旋毛虫相关的miRNA研究较少,且主要关注生理状态下与旋毛虫的发育及成熟相关的miRNA,而与致病相关的关键miRNA尚罕见报道。本研究拟采用Solexa高通量测序技术筛选旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞后差异表达的miRNA,并通过生物信息学分析对目标miRNA可能作用的靶基因进行预测并验证,探讨miRNA在旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞过程中的作用及其分子调控机制,为旋毛虫病的防治与新型预防性分子靶标的筛选提供思路。针对以上实验设计,本课题拟进行如下研究:（1）从旋毛虫肌幼虫和肠道感染性幼虫中提取RNA并进行高通量测序,real time PCR对测序结果进行验证。（2）选取目标miRNA,通过RNAhybrid、TargetScan等软件预测其可能的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因技术验证目标miRNA与其可能靶基因的作用关系,real time PCR检测目标miRNA与其靶基因在侵袭前后的表达情况,为揭示miRNA及其靶基因在旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞中的调控作用提供依据。方法1采用人工消化法收集旋毛虫肌幼虫,并用激活的肌幼虫与人回盲肠癌细胞HCT-8共孵育后收集旋毛虫肠道感染性幼虫,提取两组样品的虫体RNA用于高通量测序,real time PCR检测随机选取的部分miRNA的表达情况,以验证测序结果。2选取目标miRNA,通过RNAhybrid、TargetScan、MiRanda、PicTar等预测其可能的靶基因,合成野生型与突变型基因片段并连接PGL3-CMV-LUC-MCS载体,构建重组质粒,与miRNA mimics共转染HEK293细胞,检测报告基因表达情况,从而验证目标miRNA与其靶基因的作用关系。并采用real time PCR定量检测目标miRNA及其靶基因在侵袭前后的虫体中的表达水平。结果1高通量测序结果显示,旋毛虫幼虫侵袭宿主肠上皮细胞后,有3431个保守的miRNAs发生差异表达,其中1466个miRNAs表达上调,1965个miRNAs表达下调。此外还预测到78个新的miRNAs。从测序结果中随机选取了18个miRNAs,采用real time PCR检测其表达水平,结果与测序数据一致。2综合分析其表达情况、基因序列、生物学活性预测、调控靶基因的相关功能、以及miRNA与其靶基因结合的最小自由能（MFE）,本研究选定Tsp-let-7及其4个可能的靶基因（Tsp06966,Tsp07700,Tsp07369,Tsp14768）,采用双荧光素酶报告基因技术检测报告基因的表达情况,结果显示Tsp06966,Tsp07700是Tsp-let-7调控的潜在靶基因。另通过real time PCR检测发现在肠道感染性幼虫中Tsp-let-7表达水平明显降低,而Tsp06966,Tsp07700表达升高,提示Tsp-let-7可能通过负向调控Tsp06966,Tsp07700的表达,从而参与旋毛虫侵袭宿主肠上皮细胞的病理过程。结论1旋毛虫侵袭宿主肠上皮细胞后存在差异表达的miRNA。2 Tsp06966和Tsp07700是Tsp-let-7直接作用的靶基因。3 Tsp-let-7可能通过负向调节Tsp06966,Tsp07700的表达,参与旋毛虫侵袭宿主肠上皮细胞的调控。