论文部分内容阅读
研究目的：为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的诊断及预后寻找新的甲基化标志物,并进一步探索其表观遗传调控机制。研究方法：(1)应用Illumina 450K Infinium Methylation BeadChip对6对HCC及对应癌旁正常组织进行全基因组的甲基化基因扫描。(2)应用甲基化特异性PCR技术检测100对肝细胞癌及对应癌旁正常组织标本中FES、 CLDN11、CYP26C1、FBN1、 SEPT9、 PITX2六个基因启动子的甲基化状态。(3)应用焦磷酸测序技术检测30对肝细胞癌及对应癌旁正常组织标本中FES、CLDN11基因启动子的甲基化水平。(4)应用免疫组化技术检测FES和CLDN11在病人石蜡包埋组织中的蛋白表达情况。(5)统计学分析FES和CLDN11甲基化及其蛋白表达与临床病理参数的关系。利用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线,探讨FES和CLDN11与肝癌患者生存率的关系。通过Cox回归模型进行单因素和多因素统计分析,寻找HCC患者预后的独立危险因素。(6)单独或联合应用5-Aza-CdR和TSA处理肝细胞癌BEL-7402细胞株。运用MSP技术、qRT-PCR技术及western blot技术分别检测各组细胞中的FES和CLDN11基因甲基化状态、mRNA及蛋白表达水平变化。结果：(1)异常甲基化基因主要富集在代谢通路、RNA转运、氧化磷酸化、细胞周期、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路中,从筛选出的46个与HCC相关的基因中我们挑选了6个差异最显著的基因(FES.CLDN11、CYP26C1、FBN1、SEPT9、 PITX2)进行进一步筛选。(2)MSP结果显示,在HCC中FES和CLDN11启动子区存在较高的甲基化率,而在正常组织中的甲基化率较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)焦磷酸测序结果显示,FES和CLDN11在HCC中的甲基化程度较高,而在正常肝组织中的甲基化程度较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)免疫组化结果显示,在HCC中FES的表达率为49%,在正常组织中的表达率为92%。CLDN11在HCC中的表达率为21%,而在正常组织中的表达率为87%,差异均具有统计学意义(P<0.05)。(5)FES基因异常甲基化与HCC患者的肿瘤大小、AFP值、肿瘤分化程度相关,FES蛋白表达也与肿瘤大小、AFP值及肿瘤分化程度相关。CLDN11基因异常甲基化与HCC患者的肿瘤大小和肿瘤分化程度相关,CLDN11的表达与肿瘤大小、肿瘤分化程度及肿瘤转移有相关性(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示HCC患者生存率与肿瘤大小、AFP值、肿瘤分化程度、肿瘤转移情况、FES和CLDN11异常甲基化状态、FES和CLDN11蛋白表达情况与总体生存时间(overall survival, OS)及无进展生存期(progression-free survival, PFS)均具有相关性。Cox回归模型统计分析显示肿瘤大于5cm 、 AFP值高于50ng/ml及肿瘤低分化与OS密切相关；AFP值高于50ng/ml、肿瘤低分化、肿瘤发生转移与PFS具有相关性,是预测肝细胞癌预后的独立危险因素。(6)细胞实验表明,未加药组中FES和CLDN11基因启动子区处于完全甲基化状态。5-Aza-CdR或TSA单独处理后FES和CLDN11启动子甲基化被部分逆转,同时mRNA及蛋白表达增加,且TSA的作用比5-Aza-CdR更为显著。联合用药组中FES和CLDN11甲基化被完全逆转,mRNA及蛋白水平显著升高。结论：在HCC中,FES和CLDN11基因启动子均处于高甲基化状态,并且其蛋白表达明显低于正常肝脏组织,并参与了抑制其转录、表达的过程。使用药物5-Aza-CdR和TSA可逆转HCC甲基化状态,使基因恢复表达。