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羧肽酶Y(CPY; EC 3.4.16.5)是酿酒酵母液泡中的一种蛋白酶,是由Doi等人首次分离纯化的。羧肽酶Y由PRC1基因编码,以前体的形式进行表达。羧肽酶Y前体由20个氨基酸的信号肽,91个氨基酸的前肽和421个氨基酸的成熟区组成。该酶原中存在四个N连接的糖基化位点,羧肽酶Y前体在内质网合成,然后运输到高尔基体。由于具有广泛的底物特异性,成熟的羧肽酶Y可以将小肽C端氨基酸残基逐一释放出来,当然也包括其它羧肽酶很难水解的脯氨酸残基。基于对小肽有很强的水解能力,羧肽酶Y具有潜在的工业应用价值。先将羽毛水解为小肽混合物,再试图将羧肽酶Y应用到小肽混合物的水解。本研究的具体方案如下：1.重组载体pHBM905A-proCPY的构建通过设计两条引物,将proCPY基因从啤酒酵母INVScl基因组上扩增下来,然后克隆进毕赤酵母表达载体pHBM905A中。重组质粒经进鉴定,并且目的基因经测序后,构建正确的重组载体命名为pHBM905A-proCPY。2.毕赤酵母重组子的筛选与培养将测序正确的重组质粒pHBM905A-proCPY转化毕赤酵母GS115,毕赤酵母重组子通过BMMY培养并以1%的甲醇诱导。3.重组羧肽酶Y原的表达及去糖基化分析通过SDS-PAGE检测发现,主带大约为68 kDa比理论值58 kDa大。蛋白质印记分析表明目的蛋白得到了有效表达,并且通过总蛋白浓度测定,诱导7d后培养基上清中总蛋白量达到605 mg/L。去糖基化实验表明目的蛋白存在一定程度的N-糖基化。4.以不同方法激活的CPY的纯化与酶活测定在体外通过蛋白酶k的处理,羧肽酶Y原得到了激活,与报道情况相符。然而,我们的研究表明在不使用附加蛋白酶激活的情况下,将羧肽酶Y原发酵上清放置于10℃C,处理2周,该酶原依然可以转变成与成熟羧肽酶Y大小一样的形式。低温处理的羧肽酶Y经一系列步骤纯化,最后羧肽酶Y的肽酶活性达到305 U/mg,而激活的初酶液上清的肽酶活性为39 U/mg,纯化系数为7.9。用酯类物质作为底物时,通过薄层层析(TLC)也检测到羧肽酶Y的酯酶活性。5.CPY的酶学性质分析经酶活测定发现,重组羧肽酶Y的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0。该羧肽酶在40℃以下,pH 4.5到pH 7.0的环境中相对较稳定。6.通过CPY水解羽毛肽我们用1L的羽毛肽样品(100 mg/ml),对重组羧肽酶Y水解羽毛肽为游离氨基酸做了分析。分析表明可以检测到丝氨酸,亮氨酸,谷氨酸等13种氨基酸,总氨基酸质量分数占到了肽样品的23.12%。