脑胶质瘤是最常见的恶性肿瘤之一,手术切除为主、术后辅以放化疗是目前常用的治疗手段。胶质瘤呈浸润性生长,手术创伤及放化疗又对机体免疫力产生抑制和破坏,致使其复发率和死亡率仍然居高不下。氩氦冷冻技术是近年来兴起的一种新的肿瘤微创靶向治疗手段,可对多种良恶性肿瘤施行精确冷冻治疗,在前列腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等治疗领域已广泛应用于临床。与手术切除相比较,冷冻治疗不仅可直接杀伤肿瘤细胞,更重要的是激活机体的抗肿瘤免疫反应,从而减少肿瘤的复发,改善患者的预后。树突状细胞(DC)是机体功能最为强大的抗原提呈细胞(APC),可提呈抗原并诱导初始型T淋巴细胞活化,从而产生抗肿瘤免疫反应。DC依赖于其不同的表型和功能状态,可以促进免疫性或者免疫耐受性反应。研究表明,成熟的DC可以活化初始型T细胞,而未成熟的DC也已经应用于免疫无效能的诱导。此外,一种中等成熟程度的树突状细胞被定义为半成熟DC。这类细胞虽然可以表达中等水平的共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子,但它们却呈现出IL-12高表达、IL-10低表达的细胞表型。半成熟DC可以通过产生调节性T细胞和或T细胞无效能来诱导产生免疫耐受。树突状细胞已经被证实在抗肿瘤免疫反应中发挥着重要的作用,但同样有研究表明肿瘤的生长与DC的分化、成熟缺陷密切相关。肿瘤细胞及其分泌产生的细胞因子可以形成肿瘤微环境,在局部的肿瘤微环境中,DC前体细胞可以分化成为耐受性的半成熟DC,进而诱导产生免疫耐受和利于肿瘤免疫逃逸。Den Brok MH等学者已经报道冷冻消融肿瘤组织可以增强机体的抗肿瘤免疫反应。当DC前体细胞被肿瘤冻融产物致敏以后,可以分化、成熟,并诱导免疫反应,但是肿瘤冻融产物是否可以阻止DC前体细胞分化成为耐受性的半成熟DC呢?本研究选用小鼠GL261胶质瘤细胞系用以模拟肿瘤微环境,首先诱导DC前体细胞分化成为耐受性半成熟DC,并对其细胞表型、功能进行鉴定。然后,在耐受性半成熟DC的诱导生成过程中,添加肿瘤冻融产物,并对生成的各种DC的功能加以检测,以观察肿瘤冻融产物在此过程中发挥的作用。第一部分 C57BL/6小鼠骨髓源耐受性树突状细胞的培养和鉴定目的：探讨培养C57BL/6小鼠骨髓源耐受性树突状细胞的方法,并对其细胞形态学、细胞表面标志物及免疫学功能进行检测,为后续实验提供可靠的细胞来源。方法：获取C57BL/6小鼠骨髓细胞,联合应用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rmIL-4)细胞因子对其进行诱导培养,分为单纯DC、脂多糖LPS-DC和胶质瘤细胞培养上清TSN-DC三组,LPS-DC组在培养结束前24h加入LPS, TSN-DC组在培养开始即加入GL261胶质瘤细胞培养上清。培养6d后收集悬浮细胞,进行形态学、细胞表型和免疫学功能的鉴定。结果：三组细胞均悬浮生长,具有树突状形态。各组细胞CD11c的表达率均在90%以上,与单纯DC组细胞相比较,LPS-DC组细胞高度表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子,极少分泌IL-10,高分泌IL-12(P<0.01)；TSN-DC组细胞中度表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子,大量分泌IL-10(P<0.01),低分泌IL-12(P>0.05)。单纯DC组和TSN-DC组细胞刺激T细胞增殖的能力较弱,对GL261细胞杀伤作用也较弱,两者没有统计学差异,LPS-DC组细胞能诱导T细胞大量增殖,并对GL261细胞产生强大的杀伤作用(P<0.01)。结论：模拟肿瘤微环境,利用rmGM-CSF和rmIL-4可以从C57BL/6小鼠骨髓细胞中诱导培养出高纯度的胶质瘤耐受性树突状细胞。第二部分胶质瘤冻融产物对耐受性树突状细胞功能的影响的实验研究目的：探讨胶质瘤冻融产物在耐受性树突状细胞诱导培养过程中发挥的作用及对其免疫学功能的影响。方法：在耐受性树突状细胞诱导培养过程中的第一天、第三天、第五天,在培养体系中添加胶质瘤冻融产物,标记为L-1-TDCs, L-3-TDCs, L-5-TDCs,培养6d后收集悬浮细胞,进行形态学、细胞表型和免疫学功能如混合淋巴细胞反应、细胞毒性杀伤实验的检测。结果：相比较于L-3-TDCs, L-5-TDCs, L-1-TDCs在形态学方面更具有成熟树突状细胞的形态,并且高表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD86(P<0.01),低分泌IL-10和高分泌IL-12(P<0.01),诱导T细胞大量增殖(P<0.01),对GL261细胞产生强大的杀伤作用(P<0.01)。结论：在耐受性树突状细胞诱导培养的早期,添加胶质瘤冻融产物,可以阻止骨髓细胞向耐受性树突状细胞的分化成熟,并表现出具有成熟树突状细胞样的免疫学特性。