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重组是同源重组介导的基因工程,通过生物体内诱导产生的同源重组酶进行,是一种高效的适用于体内遗传工程的方法,不受连接酶和限制性核酸内切酶的限制,可以在任何位点实现DNA分子的重组修饰,在基因敲除、点突变等方面有广泛的应用,具有操作简单、快速高效等优点。负筛选标记是针对作为正选择标记的抗生素抗性基因而言的,含有此基因时不能存活的一种基因类型,广泛运用于基因克隆和DNA修饰。本论文提出了一种新型重组工程介导的诱导型ccdB基因的负筛选方法,据报道,与galK、thyA、sacB、tolC等负筛选标记相比,来源于F质粒、作用于DNA拓朴异构酶Ⅱ而呈现毒性的ccdB基因筛选效率最为高效。在实验中,我们选择抗生素抗性基因和诱导型cccdB基因联合使用, plac启动子置于ccdB之前使得在IPTG诱导下表达ccdB,诱导型ccdB基因作为负筛选标记,只需要加入诱导剂便可得到筛选,还可以实现对不具有耐受CcdB毒性蛋白的菌株的修饰。以大肠杆菌DH10B基因组上lacZ基因的敲除为例说明,通过PCR引入50bp的同源臂,构建HA1-aacC1-plac-ccdB-HA2的基因盒,与目的基因发生同源重组,在庆大霉素抗性筛选之下获得含有诱导型ccdB基因的突变菌株,然后利用ccdB作为筛选标记,成功获得含有mKan、 bla*目的菌株和无痕敲除的菌株。在诱导型ccdB基因的筛选下,分别将pir116基因和重组酶基因成功敲入到DH10B的lacZ区域,pirll6基因能有容纳R6K复制子的质粒,并且使其呈现高拷贝,不再仅仅局限于BUN20作为宿主菌。重组酶基因存在于突变菌株的基因组上,直接加入L-阿拉伯糖诱导重组酶表达,实现线性DNA片段间的同源重组,或实现线性DNA与环状质粒的同源重组,操作简单高效。将I-Scel基因成功敲入到MG1655的uidA区域,重组效率达到67.5%,I-SceI酶能够介导双链断裂修复,相对于质粒水平,将I-SceI基因敲入到基因组水平上比在质粒水平上更加稳定的存在与表达,对同源重组中抗性筛选标记的敲除具有重大意义。N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)以及其衍生物是非常重要的生物分子,这些糖分子往往处于大分子物质的末端,具有重要的生物学功能和医用价值。在合成Neu5Ac的方法中,全细胞催化法合成Neu5Ac的方法因其具有操作简单,成本低,环保等优点而广受欢迎。实验中在菌株LS2802的基础上,利用Red重组工程对菌株进行优化,将降低胞内GlcNAc的有关基因nagABE、manXYZ、fucIK成功敲除,阻断代谢途径,将有利于生成Neu5Ac有关的基因glmS*72、ScGNA1整合到同一基因组上共表达,获得了一系列生产神经氨酸的菌株。