论文部分内容阅读
目的:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS)是一种神经系统的变性疾病,一般认为ALS选择性损伤大脑皮层大锥体细胞及脑干运动神经核、脊髓前角的运动神经元,造成了脑和脊髓运动神经元的丢失,具体机制不明。然而在临床工作中发现ALS患者除运动系统症状外,部分伴有认知功能损害、感觉障碍、眼球运动障碍、自主神经功能障碍等运动系统外症状。因此,探讨ALS是否呈多系统累及,是我们需要关注的问题之一。
ALS伴发的运动系统损害外症状中,以认知功能损害最为常见,而海马是公认的与认知功能有关的结构。在ALS患者的尸检研究中发现患者海马区可发现泛素阳性胞质内圆形、椭圆形包涵体,支持ALS累及非运动系统,并可能与临床上常见的认知功能损害有关。
泛素系统(UPS)主要由泛素活化酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶和26S蛋白酶体组成。其广泛存在于真核生物中,降解80%以上的细胞内错误折叠蛋白或其他突变蛋白,是精细的特异性的蛋白质降解系统,是体内重要的细胞调控体系。研究认为泛素蛋白酶体降解通路失调可导致异常蛋白在细胞内积聚,并进一步引起细胞功能紊乱及变性。因此,泛素蛋白在海马区的表达异常可导致底物蛋白在细胞中异常聚集,形成胞质内包涵体,损害海马神经元细胞的正常功能,导致认知功能的损害。
本实验应用家族型肌萎缩侧索硬化动物模型-SOD1G93A转基因小鼠,通过对动物的行为学改变及海马区病理学变化的研究,探讨ALS是否存在认知功能的损害及认知功能的损害与泛素海马区异常表达的相关性,为临床研究提供理论基础。
方法:
1.实验动物模型的建立由B6SJL2 BTg(SOD12G93A)1Gur/J半合子雄鼠及B6SJLF1/J+/+雌鼠(购自美国Jackson Lab)配种,在恒温(22~27℃)、恒湿(40~50%)、无特殊病原菌的动物房中繁殖、饲养SOD1G93A转基因鼠,喂以灭菌水及颗粒型鼠类饲料。剪取小鼠尾部组织1mm,提取DNA,PCR技扩增,PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,在长波紫外光下观察条带结果,鉴定SOD1(+)小鼠及SOD1(-)同窝对照小鼠。
2.动物分组
Y型迷宫预选对电击反应较敏感,逃避反应迅速的60只小鼠(SOD1G93A转基因清洁小鼠30只、同窝阴性对照小鼠30只)供实验用。随机分为60天组、90天组及120天组(onset3.5分),每组各20只。
3.SOD1G93A转基因小鼠评分标准应用Vercelli et al的行为学评分系统于SOD1G93A转基因小鼠100天每周对动物的全身状态进行评分,1~5分定义如下:5:健康,不伴任何瘫痪症状4:轻微步态不稳及后肢瘫痪症状3:明显瘫痪及步态不稳2:后肢完全性瘫痪,动物仅靠前肢爬行1:后肢完全性瘫痪,动物主要呈侧卧位,和/或翻转后不能翻身或体重下降超过初始体重的20%。
4.跳台试验
试验分两天进行:第一天,训练前先将不同病程的SOD1G93A转基因清洁小鼠放入反应箱内自由活动3min,熟悉环境。然后将动物置于铜栅上,接通铜栅电源,通以36V交流电。动物受到电击,观察记录动物5 min内第一次找到平台的时间(为学习反应时间)及5 min内跳下平台的次数(为学习错误次数),学习反应时间及学习错误次数用以评价小鼠的学习功能。第二天,学习训练24h后,将动物置于平台上,接通铜栅电源,通以36V交流电。记录受测的动物5 min内第一次跳下平台的时间(为记忆潜伏时间),和5 min内跳下平台的次数(为记忆错误次数),记忆潜伏时间及记忆错误次数用以评价小鼠的记忆功能。
实验过程中,动物有前肢跃起指向性找到平台的动作记录入学习反应时间,前肢指向性触及铜栅记录入记忆潜伏时间及学习、记忆错误次数。
5.组织病理学在动物麻醉状态下,4%多聚甲醛左心室快速灌注,留取脑组织。4%多聚甲醛固定24h后,于视神经水平脑横断面暴露海马,梯度酒精脱水,石蜡包埋,组织切片,免疫组织化学染色,光学显微镜下观察海马区泛素的表达情况。
结果:SODlG93A转基因小鼠的记忆潜伏时间较同窝阴性对照小鼠延长,60天、90天及120天SOD1G93A转基因小鼠的记忆潜伏时间分别为68.00±47.16s,55.20±92.99s,110.10±116.52s,同窝阴性对照小鼠的记忆潜伏时间分别为65.60±89.94s,158.00±88.31s,169.80±122.96s;同时SOD1G93A转基因小鼠5min内记忆错误次数较同窝阴性对照小鼠增多,60天、90天及120天SOD1G93A转基因小鼠的5min内记忆错误次数分别为3.40±2.84次,5.20±3.08次,1.80±1.32次,同窝阴性对照小鼠的记忆错误次数分别为3-30±2.16次,2.30±1.95次,2.00±2.75次。经t检验,各组SOD1G93A转基因小鼠的记忆潜伏时间及记忆错误次数均较同窝阴性对照小鼠存在显著性改变(P<0.05),而学习反应时间及5min内学习错误次数较同窝阴性对照小鼠无明显差异性变化(P>0.05)。而随SOD1G93A转基因小鼠病程的延长,其记忆潜伏时间之间并无显著性差异(P>0.05),而5min内记忆错误次数随病程延长存在统计学意义上的增多(P<0.05)。免疫组织化学染色显示在SOD1G93A转基因小鼠海马的CA1、CA3及齿状回区均可发现泛素蛋白在细胞核周体的新月状或环形包涵体或粗颗粒状沉积,而在其同窝阴性对照的小鼠海马的CA1、CA3及齿状回区亦存在泛素的广泛表达,但表现为细颗粒状细胞质内的弥漫性广泛表达。并且SOD1G93A转基因小鼠海马CA1、CA3及齿状回区的泛素阳性反应细胞比率均较同窝阴性对照小鼠显著性增多(P<0.05)。
结论:SOD1G93A转基因小鼠的记忆功能在发病早期较同窝阴性对照小鼠已出现有统计学意义的减退,且5min内记忆错误次数随病程延长而增多,而学习功能受损不明显。但SOD1G93A转基因小鼠所表现出的记忆潜伏时间的缩短,与病程长短之间并无明显的相关性。同时,在SOD1G93A转基因小鼠的病理免疫组织化学染色可见海马区神经元核周存在显著地泛素化蛋白异常聚集,可能与之所表现出的记忆功能的受损相关。