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目的通过对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝郁脾虚证模型大鼠肝脏组织中Toll样受体4(TLR4)基因启动子甲基化水平、TLR4/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)/p65信号通路表达水平变化及逍遥散干预的研究,探讨NASH肝郁脾虚证的部分发病机制及逍遥散的治疗机制,为NASH临床研究提供理论及实验基础,揭示“肝主疏泄”的部分生物学内涵。方法1.探讨NASH肝郁脾虚证模型大鼠肝脏组织TLR4基因启动子甲基化水平的变化将65只雄性SD大鼠随机分为Normal组(Normal组,n=13)、非酒精性脂肪性肝炎模型组(NASH组,n=13)、逍遥散低剂量治疗组(XYS-L组,n=13)、逍遥散中剂量治疗组(XYS-M组,n=13)及逍遥散高剂量治疗组(XYS-H组,n=13)。Normal组大鼠饲喂普通饲料,饮用自来水,无其他干预刺激;NASH组及XYS-L、XYS-M、XYS-H组大鼠饲喂高脂饲料,饮用30%果糖溶液,每日进行慢性应激束缚刺激及饥饱失常刺激。24周后验证模型成功。各组大鼠按照前期方法继续喂养4周,同时Normal组及NASH组大鼠予以生理盐水(NS)2ml/(kg·d)灌胃,XYS-L、XYS-M、XYS-H组大鼠分别以6.48g/(kg·d)、3.24g/(kg·d)、1.62g/(kg·d)逍遥丸溶液灌胃。28周末,收集各组大鼠血液、D-木糖灌胃前后的尿液、海马组织及肝脏组织,并称量肝脏组织湿重,用于计算肝指数。实验期间观察记录各组大鼠体重、毛发、舌、活动度等情况,用于肝郁脾虚证证候积分的统计;制备大鼠肝脏组织冰冻切片,通过病理染色观察大鼠肝细胞的形态变化、脂肪变性及炎性细胞浸润程度;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)含量,尿液中D-木糖排泄率情况及海马组织中去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)含量,用于大鼠NASH肝郁脾虚证模型的检测;采用亚硫酸氢测序PCR(BSP)检测肝脏组织TLR4基因甲基化水平。2.探讨TLR4/TRIF/p65信号通路在NASH肝郁脾虚证模型大鼠肝脏中表达水平的变化28周末收集各组大鼠肝脏组织,采用ELISA法检测各组大鼠血清中白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)及一氧化氮(NO)的表达情况;采用蛋白免疫印迹法(WB)检测大鼠肝脏组织中TLR4、TRIF、p65的蛋白含量;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测TLR4、TRIF、p65的mRNA含量;对大鼠肝脏组织TLR4基因mRNA相对表达含量与其甲基化水平做相关性分析。结果1.NASH肝郁脾虚证模型大鼠肝脏组织中TLR4基因启动子甲基化水平的变化(1)病理切片观察:各组大鼠肝组织HE染色及油红O染色结果显示,与Normal组比较,NASH组大鼠肝细胞体积增大,胞浆内出现大量脂肪空泡,炎性细胞浸润明显,并伴随明显的肝纤维化;与NASH组比较,XYS-L、XYS-M、XYS-H组大鼠肝细胞体积均有缩小,胞浆内的脂肪空泡及炎性细胞浸润程度、肝纤维化均有不同程度减轻,其中,XYS-M组减轻程度最为明显。(2)肝指数及血清指标检测:与Normal组比较,NASH组大鼠肝指数升高(P<0.01),血清中AST(P<0.05)、ALT、TG及TC的含量均明显升高(P<0.01);与NASH组比较,XYS-L、XYS-M组肝指数明显下降(P<0.05),血清中XYS-L组ALT(P<0.05)、TG(P<0.01)及TC(P<0.01)的含量均显著下降,XYS-M组AST(P<0.01)、ALT(P<0.01)、TG(P<0.05)及TC(P<0.01)的含量均显著下降,XYS-H组TG(P<0.01)的含量显著下降。(3)肝郁脾虚证证候积分:与Normal组比较,NASH组肝郁脾虚证证候积分有显著升高(P<0.01);与NASH组比较,XYS-L、XYS-M、XYS-H组证候积分均明显降低(P<0.01)。(4)大鼠尿液D-木糖排泄率及海马组织中5-HT、NE含量检测:与Normal组比较,NASH组大鼠尿液D-木糖排泄率及海马组织中5-HT、NE含量降低(P<0.01);与NASH组比较,XYS-L组尿液D-木糖排泄率(P<0.01)及5-HT(P<0.01)、NE(P<0.05)含量升高,XYS-M、XYS-H组尿液D-木糖排泄率及海马组织中5-HT、NE含量升高明显(P<0.01)。(5)肝脏组织中TLR4基因甲基化水平检测:与Normal组比较,NASH组大鼠肝脏组织中TLR4基因甲基化水平明显降低(P<0.01);与NASH组比较,XYS-L(P<0.05)、XYS-M(P<0.01)组TLR4基因甲基化水平显著升高。2.肝组织TLR4/TRIF/p65信号通路在NASH肝郁脾虚证大鼠模型中表达水平的变化(1)大鼠血清中细胞因子检测结果:与Normal组比较,NASH组大鼠血清中IL-10、TGF-β含量下降明显(P<0.01),TNF-α、IL-1β及NO含量显著升高(P<0.01);与NASH组比较,XYS-L组血清中IL-10(P<0.01)表达明显升高,IL-1β及NO表达明显降低(P<0.01),XYS-M组血清中IL-10(P<0.01)、TGF-β(P<0.05)表达升高,TNF-α、IL-1β及NO含量显著下降(P<0.01),XYS-H组血清中IL-10(P<0.01)表达升高明显,IL-1β及NO含量显著下降(P<0.01)。(2)大鼠肝脏组织TLR4、TRIF、p65蛋白含量的检测结果:与Normal组比较,NASH组大鼠肝脏组织中TLR4、TRIF、p65的蛋白含量升高(P<0.01);与NASH组相比,XYS-L肝脏组织中TLR4(P<0.01)、TRIF(P<0.01)、p65(P<0.05)的蛋白含量降低,XYS-M、XYS-H组肝脏组织中TLR4、TRIF、p65的蛋白含量显著降低(P<0.01)。(3)大鼠肝脏组织中TLR4、TRIF、p65的mRNA相对含量检测结果:与Normal组比较,NASH组大鼠肝脏组织中TLR4、TRIF、p65的mRNA相对含量显著升高(P<0.01);与NASH组比较,XYS-L肝脏组织中TLR4(P<0.01)、TRIF(P<0.01)、p65(P<0.05)的mRNA相对含量降低,XYS-M、XYS-H组肝脏组织中TLR4、TRIF、p65的mRNA含量均显著降低(P<0.01)。(4)肝脏组织TLR4基因mRNA相对含量与其甲基化水平的相关性分析:TLR4的甲基化水平与其mRNA相对含量的表达呈负相关(P<0.01)。结论1.NASH肝郁脾虚证模型大鼠的发病可能与肝脏组织TLR4启动子甲基化水平的下调及TLR4/TRIF/p65信号通路表达的升高有关。2.NASH肝郁脾虚证大鼠肝脏组织TLR4/TRIF/p65信号通路表达的升高可能与TLR4启动子甲基化水平的下调有关。3.逍遥散中等剂量能更好地对NASH肝郁脾虚证大鼠起到治疗作用。4.逍遥散通过上调非酒精性脂肪性肝炎肝郁脾虚证模型大鼠中TLR4基因甲基化水平,下调TLR4/TRIF/p65信号通路的表达,从而改善肝脏组织脂肪变性程度、炎症反应及模型大鼠肝郁脾虚症状,这可能是我们对逍遥散治疗非酒精性脂肪性肝炎肝郁脾虚证认识的新机制。