急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是源于造血干细胞异常的恶性克隆性疾病，含有大量异质性(heterogeneous)细胞亚群是其典型特征之一。 采用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)，开创了靶向治疗白血病的先河并取得了革命性的成功。95％以上的APL患者都具有t(15；17)染色体易位而形成PML/RARα融合基因，ATRA靶向降解PML-RARα融合蛋白，恢复野生型RARα和PML基因功能，解除融合蛋白对基因转录的抑制，消除其对细胞分化的阻遏及对凋亡的抑制，进而治疗APL。ATRA极大地提高了APL的完全缓解率(CR)，ATRA+CT(化学治疗)可使APL达到了分子遗传学上的治愈。近年来与AML发生发展密切相关的其他基因突变也被发现，包括Flt3内部串联重复(internal tandem duplication，ITD)，Flt3酪氨酸激酶域突变(tyrosine kinase domain，TKD)，c-Kit以及Ras等，这些突变往往异常激活信号传导而使白血病细胞获得增殖优势和凋亡逃逸能力。近年来，一种新的参与细胞有丝分裂的丝氨酸/苏氨酸激酶家族——Aurora激酶家族，包括Aurora-A，-B和-C被逐渐认识，该激酶家族在调控染色体准确分离从而维持染色体稳定性的机制中起着关键性作用。Aurora-C在精子中高表达，其功能可能与精子发生有关。Aurora-B与另3个染色体过客蛋白(chromosome passenger protein)——内着丝粒蛋白(INCENP)、Survivin和Borealin结合形成复合物，此复合物有调节动原粒(centromere)的功能，是纠正染色体排列和分离、调整纺锤体检查点(check point)功能和胞质分裂所必需的。Aurora-A激酶作为参与细胞有丝分裂的关键因子，其主要功能包括调节G2/M转变，中心体分离、成熟，纺锤体装配和稳定以及胞质分裂，这些都提示了Aurora-A激酶在调节染色体稳定性方面扮演着重要的角色。而Aurora-A之所以倍受关注是因为它与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，在NIH3T3细胞中异源表达Aurora-A可以导致细胞转化(transformation)以及染色体数目异常；用活化型Aurora-A转化Rat1细胞后可以使裸鼠致瘤，它是一种潜在的癌基因。事实上，已在血液系统恶性疾病如非何杰金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)及多种恶性实体肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等中发现有Aurora-A的高表达，并且这种高表达同肿瘤组织细胞的非整倍体相关，同时往往伴随着预后较差的临床病理分期、较差的临床疗效及更低的远期生存率等，均提示预后不良。但VX-680潜在的抗白血病机制及其与AML中Aurora激酶表达的关系目前仍不清楚。为此，本研究作了如下探讨： 1、Aurora-A激酶在AML中的表达收集了98例原发初治的AML患者及12名健康志愿者的骨髓标本，分离及培养骨髓原代细胞，同时选择了2株AML细胞系，利用Western blot及免疫细胞化学染色的方法检测了Aurora-A激酶蛋白在AML骨髓原代细胞及AML细胞株中的表达情况。 本实验旨在通过观察Aurora-A激酶蛋白在AML细胞中的表达情况，分析其与AML患者临床各指标间的关系，为其作为AML治疗的新靶点提供理论依据。 2、VX-680抑制AML细胞生长并诱导其凋亡的研究我们尝试将Aurora-A激酶小分子抑制剂VX-680作用于AML，原代细胞、正常骨髓原代细胞以及AML细胞株。本实验拟尝试将Aurora-A激酶小分子抑制剂VX-680作用于AML细胞，观察其对AML细胞牛长增殖及诱导凋亡的影响，以明确该小分子抑制剂靶向治疗AML的作用。 3、VX-680靶向Aurora-A激酶高表达AML细胞亚群的特异性研究利用统计学方法深入分析了AML患者及正常骨髓细胞对Aurora-A激酶小分子抑制荆VX-680诱导细胞凋亡的作用反应不一的原因。利用Western blot法检测了其他激酶如Aurora-B激酶和FLT3在AML及正常骨髓原代细胞中的表达，同时还利用PCR法检测了FLT3基因突变的情况。结合这些因素深入分析了VX-680靶向作用AML细胞的特异性靶点。 本实验旨在寻找VX-680靶向作用AML细胞时最特异的细胞亚群，为其将来应用于临床治疗提供可参考的适用指征。 4、WX-680诱导AML细胞凋亡的分子机制在结合细胞周期同步化方法的基础上利用流式细胞术分析了VX-680对AML细胞的细胞周期的影响；利用免疫细胞荧光双染色法观察了VX-680对AML细胞纺锤体形成的影响；利用Western blot法检测了VX-680作用与AML细胞后线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况；拟用RNA干扰的方法降低AML原代细胞及HL-60细胞中Aurora-A激酶的表达，观察siRNA作用后细胞周期、纺锤体形成、凋亡通路信号蛋白的改变，并与VX-680的作用后的效应相比较。 本实验通过观察VX-680对AML细胞的细胞周期以及凋亡信号传导通路相关蛋白表达情况的影响，以明确VX-680诱导AML细胞发生细胞凋亡的分子机制。 5、VX-680与VP16联合诱导AML细胞凋亡的作用研究将VX-680与VP16联合作用于AML及正常骨髓原代细胞，利用AnnexinV-FITC/PI双染色法以及流式细胞术观察药物作用后的细胞凋亡情况；采用不同的给药顺序，评价顺序给药(sequential therapy)与联合用药(combined therapy)间对细胞凋亡作用的不同影响。 本实验拟通过研究VX-680与VP16联合诱导AML骨髓原代细胞凋亡的药物效应，明确VX-680与AML传统化疗药物间的联合作用，评价其治疗AML的临床应用潜力。 本课题研究的结果及意义总结如下： 1、首次明确了Aurora-A激酶蛋白在原发初治AML患者骨髓原代细胞及AML细胞株中的异常高表达，并发现在原发初治AML骨髓中该激酶蛋白的高表达往往伴有外周血高白细胞计数。不仅揭示了Aurora-A激酶作为一种新的白血病标志物可能与AML的发生及预后密切相关，也为其作为分子靶向治疗的新靶点提供了理论依据。 2、明确了Aurora-A激酶小分子抑制剂VX-680能够剂量及时间依赖性的抑制AML细胞生长并诱导细胞凋亡，显示出了其对白血病细胞产生的强大的细胞毒性作用；更重要的是，VX-680能够特异性的靶向诱导Aurora-A高表达的AML原代细胞亚群发生凋亡，而对Aurora-A低表达的AML细胞群或正常骨髓细胞活性影响较小：观察到VX-680与传统化疗药物VP16联合诱导AML细胞凋亡具有协同效应。因此，VX-680作为新的分子靶向药物以其特异性高，效果显著，毒性低而显示出了其在治疗AML中的光明前景。 3、阐明了VX-680诱导AML细胞凋亡的分子机制，包括：G2/M期阻滞、纺锤体单极化、Akt活性下调、PARP剪切、Caspase通路的激活以及上调促凋亡因子Bax，同时下调抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达，从而介导线粒体途径的凋亡等多种机制。首次报道了VX-680作用后导致Bax/Bcl-2比例增高，该指标与临床疗效具有显著相关性，常伴有较好的预后，进一步证明了Aurora-A激酶小分子抑制剂VX-680用于治疗AML的巨大潜力。