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在生物体内,pre-mRNAs总是和蛋白质结合的,裸露的RNA特别容易降解,在现在的试验条件下,很困难去萃取、提纯和结晶RNA。迄今为止,通过X-晶体衍射或核磁共振(NMR)尚未测定全长的pre-mRNAs,在体内更难以测定RNA的结构。在当今RNA结构分析中,理论预测和模拟起着日趋重要的作用。在进行RNA的二级结构预测时,如何考虑细胞中RNA合成过程的共转录折叠,是一个非常有意义的问题。
对于序列、结构、功能和医学背景,血红蛋白基因是研究得最清楚的基因之一,但对于pre-mRNA的折叠和剪接机制还是不清楚。鉴于从实验上剖析共转录折叠精细结构的困难,本文构造了一种称之为“动态延伸折叠模拟”方法,以人珠蛋白基因的pre-mRNA为对象,详细“表演”了共转录折叠的图象。模拟过程以30nt为起始序列,每次顺序增加30nt,1~30,1~60,1~90,1~120,……,1~the end nt,采用RNAstructure二级结构预测程序,得出每一个片断序列的折叠二级结构。结果发现,有些发夹是“保守”的,出现于某一时刻就一直存在至其后的所有折叠中。有些出现于部分折叠片断,有些仅出现一两次。这种情况生动地再现了共转录折叠中那些暂时性结构单元的生成与调整。正是这些发夹,支撑了RNA合成结束时的热力学稳定结构,它们有可能影响到RNA的剪接加工,甚至蛋白质合成的折叠结构。
动态延伸折叠的结果分析提示,在某种意义上,外显子连接的再折叠,加入了共转录折叠和剪接作用。一种稳定的折叠框架结构,对于认识剪接位点的精确识别和剪接的顺式元件发挥作用的机理足必要的。
为了使预测所得到的mRNA的二级结构更加接近于mRNA的天然结构,本文用动态延伸折叠模拟方法,基于表征RNA二级结构的一维符号序列,得到人血红蛋白pre-mRNA二级结构中较为保守的发央模体(hairpin motif)和链构象,经过pre-mRNA内含子的剪接加工及再折叠重要步骤,并且对其进行对比分析,从而建立mRNA折叠二级结构的“框架结构”。
10个珠蛋白基因的人类pre-mRNA分子中,唯有HBA2和HBA1的CDS完全相同。但更突出的特征是:两者的pre-mRNA和成熟mRNA的折叠二级结构,特别是“框架结构”,均存在着与生物学功能相关的结构性异同,框架结构比较简单、比较普适,因而具有很高的保守性。
通过分子建模对HBA2和HBA1成熟mRNA框架结构中的相同部分,即以多分支环4为核心的区域,构建了一个三维模型。结果显示,动态延伸折叠模拟得到的mRNA二级结构元件的保守程度不同,相对应的部分在三维构象中的规则程度也有差异。在二级结构中,分支环上较为保守的部分在三维结构中倾向于更加规则。
我们的工作对mRNA的折叠和剪接机制提出了新的见解,并为进一步的研究打下了基础。本文的研究还提示,我们构建的mRNA框架结构可能成为替代其天然结构的,一种能够保持基本生物学功能的简洁而有效的实用结构。