论文部分内容阅读
中国是一个气候多样的大陆国家,拥有比其他国家更丰富的梨属种质资源。梨属(Pyrus)起源于中国西部和西南部的山区,而中国东部和中亚被认为是梨的遗传多样性的两个亚中心。最近,南京农业大学梨工程技术研究中心完成了对亚洲梨之一的中国白梨(Pyrus bretschneideri Rehd)的完整基因组测序。梨基因组的解码,使梨几乎所有的基因序列变为己知,为梨的生物学研究提供了新的资源。通过全基因组功能和比较研究使得研究人员能够深入了解生物机制以及鉴定出的新的基因家族。关于植物转录因子的现有研究大多数来自拟南芥(Arabidopsis thaliana),其具有2,296个转录因子基因,分为58个家族,而在梨中已经鉴定了 42,812子基因。迄今为止,学者对梨的9个基因家族和4个转录因子家族进行了全基因组分析,目前对潜在转录因子的研究非常有限,因此需要对涉及梨的果实着色,非生物胁迫耐受性和芽休眠的植物发育相关的转录因子进行全基因组分析。因此,基于我们之前的研究,我们选择梨中的CBF/DREB和NAC转录因子,在亚洲梨中进行系统发育,结构,调控和功能鉴定研究。CBF/DRE转录因子在多种适应性机制,分子信号转导以及对植物非生物胁迫的耐受性方面发挥作用。在梨和其他蔷薇科作物中,需要研究CBF亚家族的独立进化,以了解它们可能的不同功能。我们从梨基因组中发现了 15个PpPCBF,但序列的相似性>0.90,对于那些具有类似的系统发育分支(PpyCBFs 7,8,9,10,11,12,13,14)、不完整序列(PpyCBF12)和在 Scaffold上(PpyCF7,8,10,11,13,14,15)的基因没有进行后续研究,而我们选择其保守序列即PpyCBFsl-6开展进一步研究。系统发育树将PpyCBF分成三个主要的进化枝/亚型,有趣的是PpyCBF与其他蔷薇科植物一起显示出与模式作物拟南芥AtCBFs的独立进化。第一进化枝不仅具有来自双子叶植物和单子叶植物作物的CBF,而且还具有PpyCBF3共线性基因,其表明PpyCBF3可能是祖先CBF,而所有其他CBF在梨的全基因组复制(WGD)过程中从PpCBF3进化而来。对所有6个PpyCBF在非生物胁迫(低温,盐和干旱),外源ABA和芽内休眠期间的表达进行分析,结果表明,所有PpyCBF基因表达均被诱导,但对各种胁迫,ABA处理和芽内休眠过程的响应有所差异。这些CBF表达模式类似于胁迫响应相关基因PpyCOR(PpyCOR47,PpyCOR15A,PpyRD29A和PpyKIN)。第二枝PpyCBFs在低温和ABA处理期间显示出更高的转录水平,而发现Ⅰ和Ⅲ进化枝更多的是响应盐和干旱反应。启动子分析显示,I(PpyCBF3)和Ⅲ进化枝(PpyCBF5)CBF缺乏G-boxl顺式元件,存在ABRE顺式元件,表明它们仅受ABI3/VP1级联调控,而Ⅱ进化枝PpyCBF受到b-ZIP和ABI3转录因子的调控。在拟南芥中异位表达PpyCBF2和PpyCBF3增强了其对非生物胁迫(尤其是低温(PpCBF2)以及盐和干旱胁迫(PpyCBF3)、更低的ROS的耐受性,并增加了抗氧化基因活性。正常生长条件下,在PpyCBF2、3过表达拟南芥中,依赖内源性ABA(AtABF2和AtRD29BA和不依赖ABA的(AtCOR47,AtCOR15A和AtRD29A)胁迫相关基因的表达增加,表明PpyCBF发挥功能可能拥有依赖ABA和不依赖于ABA的两条途径。所有PpyCBF尤其是祖先CBF具有6X CCGAC结合元件的高反式激活活性。通过荧光素酶和酵母单杂交实验,我们发现所有CBF均与PpyCOR47和PpyCOR15A(PpyCBF6除外)发生互作,而Ⅱ进化枝PpyCBF对PpyRD29A具有高于Ⅰ和Ⅲ进化枝PpyCBF的调控作用。先前鉴定的’CCGA’结合位点和PpyCOOR15A启动子中’CGACA’结合位点的突变显示’CGA’是梨中PpyCBF的核心结合元件。总之,PpyCBF转录因子可能通过依赖ABA和不依赖ABA两条途径冗余地发挥作用,并且与亚洲梨的非生物胁迫信号和响应密切相关。NAC蛋白在不同的植物发育过程以及对生物和非生物胁迫的耐受性中发挥作用。梨基因组的解码为找到PpNAC转录因子的进化、复制、基因结构和预测功能的全基因组分析提供了基础。我们在梨中共发现185个PpNAC基因,其中148个位于染色体上,37个位于未组装的Scaffold上。在11号染色体上观察到最大PpNAC基因频率(11%),随后是10号染色体(9%),而16号和7号染色体(1%和1.6%)展现出最小的频率。通过系统发育分析,我们将NAC基因分为6个进化枝(第1组-第6组)及其亚进化枝(亚组A至亚组H),而第1组是最大的,有40个PpNAC基因和8个亚组(1A-1H),其次是第2组和第6组,分别具有34个基因和4个(2A-2D)和3个(6A-6C)亚组。基因结构和基序分析表明,具有相似基因结构和基序的NAC蛋白存在于相同的亚组中,每组显示共同的基序,没有/微小的变化使其具有相似的功能。每组的外显子数量从1到12不等,平均为3个外显子。在亚洲梨中有44对重复的NAC。不同梨品种/种的qPCR和RNA-Seq数据分析验证了 PpNAC基因的一些预测功能,即PpNAC 37,61,70(2A,53,151(2D),10,92,130和154(3D)是可能参与芽休眠,PpNA 61,70(2A),172,176和23(4E)与蓝光下果实色素沉着有关,PpNACs127(1E),46(1G)和56(5A)可能分别与早期、中后期果实发育有关。此外,通过针对梨中的应激反应基因,发现来自亚组2D和3D的所有基因与非生物胁迫(冷,盐和干旱)耐受性相关。目前全基因组分析为了解梨和高等植物中NAC基因家族的分类,基序和基因结构,进化和预测功能提供了有价值的信息。总之,PpNAC转录因子在梨的非生物胁迫耐受性,果实发育和成熟,果实后熟和着色以及芽休眠等多条途径中扮演着不同的角色。