论文部分内容阅读
目的：2型糖尿病（type2diabetes mellitus，T2DM）患者血清能通过氧化应激损伤内皮细胞并与β‐淀粉样肽（amyloid-β，Aβ）40、Aβ42有关。但是T2DM患者Aβ水平升高的原因尚不清楚，单纯的血糖升高能否通过影响Aβ40、Aβ42的水平而损伤内皮有待进一步的研究。因此，利用高糖及波动性高糖对人脐静脉内皮细胞株（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）进行干预，探讨高糖及波动性高糖对内皮细胞的损伤，及损伤是否与Aβ40及Aβ42相关。方法：1.取对数生长期的HUVECs接种于培养皿并同步化后，分别用含有糖浓度为5.5mmol/L（Normal glucose group，NG组）、11mmol/L（High glucose group1，HG1组）、20mmol/L（High glucose group2，HG2组），甘露醇浓度为14.5mmol/L（Mannitolgroup，MG组）的1640培养液干预30min、3h以及3d，用含5.5/20mmol/L葡萄糖（先用葡萄糖浓度为5.5mmol/L的培养液干预24h，然后换用葡萄糖浓度为20mmol/L的培养液干预24h，最后再换用葡萄糖浓度为5.5mmol/L的培养液干预24h，Intermittent glucose group1，IG1组）或含20/5.5mmol/L葡萄糖（先用葡萄糖浓度为20mmol/L的培养液干预24h，然后换用葡萄糖浓度为5.5mmol/L的培养液干预24h，最后再换用葡萄糖浓度为20mmol/L的培养液干预24h，Intermittentglucose group2，IG2组）的培养液干预3d。2.倒置显微镜观察细胞形态学变化。干预30min、3h、3d后分别取各组细胞上清液，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，评定细胞抗氧化能力；硫代巴比妥酸法测定丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量，评定脂质过氧化情况；硝酸还原酶法测定一氧化氮（nitric oxide，NO）浓度，了解内皮功能；化学比色法测定乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，了解细胞或细胞膜损伤程度；ELISA法检测Aβ40及Aβ42的含量，了解高糖及波动性高糖对Aβ40和Aβ42的影响。结果：1.细胞形态学变化NG、HG1、HG2、MG组在倒置显微镜下观察，30min及3h各组细胞形态无明显变化。3d时，NG、HG1、MG组细胞轮廓清晰，多呈梭形，大小均匀，呈鹅卵石状紧密排列，HG2组细胞轮廓不清楚，细胞变圆、皱缩，胞体碎裂，IG1、IG2组细胞变化更加明显，且细胞变小及数量减少。2. HUVECs培养上清中MDA的变化在同一时间段，干预30min时各组MDA含量无显著差异（P＞0.05）；干预3h时，与NG组比较，HG1、MG组无显著性差异（P＞0.05），HG2组MDA含量显著增高（P=0.000），与HG1组比较，HG2、MG组无显著差异（P＞0.05），与HG2组比较，MG组MDA含量显著减少（P=0.000）；干预3d时，与NG组比较，HG1、HG2、IG1、IG2组MDA含量显著增高（P值均为0.000），MG组无显著差异（P＞0.05），与HG1组比较，HG2、IG1、IG2组MDA含量显著增高（P值分别为0.000，0.001，0.000），MG组MDA含量显著减少（P=0.000），与HG2组比较，IG1、IG2组含量显著增加（P值分别为0.000，0.003），MG组含量显著减少（P=0.002）。IG1与IG2组间无显著差异（P＞0.05）。不同时间段进行组内比较，NG组30min、3h、3d时MDA含量无显著差别（P＞0.05）；在HG1组内，与30min比较，3hMDA含量无显著差异（P＞0.05），3d含量增加显著（P值为0.000），与3h比较，3d时MDA含量增加显著（P=0.001）；在HG2组内，与30min比较，3h、3d时MDA含量显著增高（P值分别为0.001，0.000），与3h比较，3d含量增高显著（P=0.000）； MG组各时间段无显著差异（P＞0.05）。3. HUVECs培养上清中SOD的变化在同一时间段，干预30min时各组SOD活力无显著差异（P＞0.05）；干预3h时，与NG组比较，HG1、MG组无显著差异（P＞0.05），HG2组SOD活力显著减少（P=0.000），与HG1组比较，HG2、MG组无显著差异（P＞0.05），与HG2组比较，MG组SOD活力显著增多（P=0.000）；干预3d时，与NG组比较，HG1、HG2、IG1、IG2组SOD活力显著减少（P值均为0.000），MG组无显著差异（P＞0.05），与HG1组比较，HG2、IG1、IG2组SOD活力显著减少（P值均为0.000），MG组SOD活力显著增加（P=0.000），与HG2组比较，IG1、IG2组SOD活力显著减少（P值分别为0.002，0.005），MG组活力显著增加（P=0.001）。IG1与IG2组间无显著差异（P＞0.05）。不同时间段进行组内比较，NG组30min、3h、3d时SOD活力无显著差别（P＞0.05）；在HG1组内，与30min比较，3h的SOD活力无显著差异（P＞0.05），3d活力减少显著（P=0.000），与3h比较，3d时SOD活力减少显著（P=0.001）；在HG2组内，与30min比较，3h、3d时SOD活力减少显著（P值分别为0.001，0.000），与3h比较，3d的SOD活力减少显著（P=0.000）； MG组各时间段无显著差异（P＞0.05）。4.HUVECs培养上清中NO的变化在同一时间段，干预30min、3h时各组NO含量无显著差异（P＞0.05）；干预3d时，与NG组比较，HG1、HG2、IG1、IG2组NO含量显著减少（P值均为0.000），MG组无显著差异（P＞0.05），与HG1组比较，HG2、IG1、IG2组NO含量显著减少（P值均为0.000），MG组NO含量显著增加（P=0.000），与HG2组比较，IG1，IG2组NO含量显著减少（P值均为0.000），MG组含量显著增高（P=0.004）。IG1与IG2组间无显著差异（P＞0.05）。不同时间段进行组内比较，NG组与30min比较，3h、3d时NO含量显著增加（P值分别为0.002，0.000），与3h比较，3d时NO含量显著增加（P=0.003）；在HG1组内，与30min比较，3h、3d时NO含量显著减少（P分别为0.001，0.000），与3h比较，3d时NO含量减少显著（P=0.001）；在HG2组内，与30min比较，3h、3d时NO含量显著减少（P值分别为0.001，0.000），与3h比较，3d含量减少显著（P=0.04）； MG组内与30min比较，3h的NO含量显著增高（P=0.002），3d的NO含量显著增高（P=0.003），与3h比较，3d的NO含量显著增加（P=0.008）。5. HUVECs培养上清中LDH的变化在同一时间段，干预30min时，与NG组比较，HG1、MG组LDH活性无显著差异（P＞0.05），HG2组LDH活性显著增高（P=0.000）与HG1组比较，HG2组活性显著增高（P=0.005）与HG2组比较，MG组活性显著降低（P=0.003）；干预3h时，与NG组比较，MG组无显著差异（P＞0.05），HG1、HG2组LDH活性显著增高（P值均为0.000），与HG1组比较，HG2组活性显著增高（P=0.000），MG组活性显著降低（P=0.005），与HG2组比较，MG组LDH活性显著减少（P=0.009）；干预3d时，与NG组比较，HG1、HG2、IG1、IG2组LDH活性显著增高（P值均为0.000），MG组无显著差异（P＞0.05），与HG1组比较，HG2、IG1、IG2组LDH活性显著增高（P值分别为0.000，0.001，0.000），MG组LDH活性显著减少（P=0.000），与HG2组比较，IG1、IG2组LDH活性显著增加（P值分别为0.000，0.003），MG组LDH活性显著减少（P=0.002）。IG1与IG2组间无显著差异（P＞0.05）。不同时间段进行组内比较，NG组30min、3h、3d时LDH活性无显著差别（P＞0.05）；在HG1组内，与30min比较，3h、3d的LDH活性增加显著（P值均为0.000），与3h比较，3d时LDH活性增加显著（P=0.001）；在HG2组内，与30min比较，3h、3d时LDH活性显著增高（P值分别为0.018，0.000），与3h比较，3d含量增高显著（P=0.000）； MG组各时间段无显著差异（P＞0.05）。6. HUVECs培养上清中Aβ40和Aβ42的变化同一时间段内各组Aβ40和Aβ42的浓度均无显著差异（P＞0.05），组内在不同时间段进行比较，Aβ40和Aβ42浓度也无显著差异（P＞0.05）。结论：1.恒定高糖及波动高糖均可以增加血管内皮MDA的生成、降低SOD的活力、增加LDH活性和减少NO的产生，具有一定的时间依赖性和浓度依赖性，同时波动高糖使其变化更加显著。表明糖浓度增加能够损伤内皮细胞，且波动高糖损伤更大，与临床DM血管并发症具有一致性。因此，控制DM患者高血糖，保持血糖平稳，有助于减少血管内皮损伤，延缓DM血管并发症的发生。2.恒定高糖及波动高糖坏境下，内皮细胞Aβ40、Aβ42的水平无明显变化，提示单纯高糖及波动性高糖对内皮的损伤与Aβ40、Aβ42无关。Aβ40、Aβ42的变化可能与其他因素或高糖与其他因素的共同作用有关。