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目的:1.检验h ADSC-EV是否能够促进成骨分化;2.探索将MSC-EV用于Ti材料表面改性的可行性;3.研发一种适用于金属植入物表面锚定MSC-EV的方式;4.检验经h ADSC-EV表面活化改性的Ti材料是否具备更好的促进骨再生能力,为临床医用金属植入物的表面改性提供新的思路。方法:1.采用超速离心法制备h ADSC-EV,并通过SEM、颗粒跟踪分析、Western-blot等方式对其进行鉴定;以人成骨样细胞MG63为对象,通过茜素红染色与钙定量检测等方式检验h ASC-EV是否具备促进成骨分化的作用;通过基因芯片以及生物信息学分析等手段对h ASC-EV中可能发挥生物学效应的物质进行初步筛选。2.应用恒电位法制备Bio-Ppy-Ti(生物素-聚吡咯-钛),设置实验分组:Ti、Ppy-Ti、Bio-Ppy-Ti,通过SEM、AFM、荧光显像等手段对各组材料的表面形貌、粗糙度以及生物素负载量进行表征;将生物素修饰的h ADSC-EV孵育到Bio-Ppy-Ti表面,通过共聚焦观察比较第0天、第7天与第14天材料表面的EV残留量,检测锚定的长效性;将生物素修饰的h ADSC-EV分别孵育到各组材料表面后进行超声震荡处理,通过SEM以及共聚焦显微镜观察各材料表面EV的残留量,检测锚定的稳定性。3.设置实验分组:Ti、Bio-Ppy-Ti、EV-Bio-Ppy-Ti,在不同材料表面接种人成骨样细胞MG63,通过F-actin染色比较早期不同时间点(6h、12h、24h)的细胞形态以及黏附情况;培养14天后,通过q RT-PCR与免疫荧光观察细胞在不同材料表面培养后成骨相关基因(ALP、COL1、OCN)与蛋白(COL1、OCN)的表达;在不同材料表面接种人成骨样细胞MG63并培养14天,随后埋植裸鼠(Balb/c,雌性,8-9周龄)皮下,一个月后对局部组织进行HE及免疫组化分析。结果:1.添加10μg/m L h ADSC-EV培养MG63细胞14天后,细胞内外总钙含量为1.1855±0.1860 mmol/L,而空白对照组为0.1418±0.0120 mmol/L,阴性对照组(h DFEV)为0.1729±0.0370 mmol/L,其中h ADSC-EV组的钙含量相对于空白对照组与阴性对照组显著提高。进一步在表达量前30位的h ADSC-EV mi RNA中筛选到5种可以调控成骨分化的mi RNA。2.通过电化学聚合法可成功在Ti表面聚合Bio-Ppy涂层,电化学聚合条件为1.5V、120s时,Bio-Ppy-Ti表面的生物素掺杂量最多;生物素化的h ADSC-EV在Bio-Ppy-Ti表面孵育7天与14天后,EV的残留量分别为初始状态的96.17%与94.67%;生物素化的h ADSC-EV孵育到各组材料进行超声震荡处理30s后,Ti、Ppy-Ti与Bio-Ppy-Ti表面的EV残留量分别为初始状态的0.34%、0.67%与62.74%,其中Bio-Ppy-Ti组显著高于Ti组与Ppy-Ti组。3.在不同材料表面接种MG63细胞培养6小时后,Ti、Bio-Ppy-Ti与EV-Bio-Ppy-Ti表面的细胞投影面积分别是946.42±69.32μm2、841.69±147.98μm2与1361.26±163.14μm2,其中Bio-Ppy-Ti组显著高于Ti组与Ppy-Ti组;在不同材料表面接种MG63细胞培养14天后,EV-Bio-Ppy-Ti组中细胞的ALP基因、COL1基因与OCN基因的表达量分别为Ti组的1.27倍、1.68倍与1.82倍,其差异具有统计学意义;不同材料经裸鼠皮下植入一个月后,EV-Bio-Ppy-Ti组的皮下组织中可见少量散在分布的OCN阳性细胞,而Ti组与Bio-Ppy-Ti组的皮下组织内未见OCN阳性表达的细胞。结论:1.h ADSC-EV可以在体外促进成骨样细胞MG63的成骨分化;h ADSC-EV中富含多种可以调控成骨分化的mi RNA。2.通过恒电位法可在Ti表面制备出Bio-Ppy涂层,在1.5V、120s聚合条件下生物素的掺杂含量最多;h ADSC-EV能通过ABC法在Bio-Ppy-Ti表面长期负载达14天;h ADSCEV能通过ABC法在Bio-Ppy-Ti表面稳定负载,至超声震荡300s后才全部脱落。3.经h ADSC-EV修饰的Ti材料能够促进成骨细胞的早期黏附与伸展;同时,经h ADSC-EV修饰的Ti材料能够在体内与体外促进成骨细胞中成骨相关基因与蛋白的表达。