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研究背景与目的:肾细胞癌（RCC）是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,是泌尿系统常见的恶性肿瘤,约30%左右患者被诊断出肾癌时已经有转移症状,这些RCC患者的预后和总体生存极差,晚期肾癌一般用分子靶向药物治疗,即便如此,部分患者会出现对靶向治疗的先天性耐药或者继发耐药,导致治疗效果不佳。近年来,随着人们对Gab2研究的不断深入,大量的研究证明Gab2蛋白在多种恶性肿瘤中表达异常,已知恶性肿瘤疾病包括有乳腺癌、白血病、卵巢癌,黑色素瘤及肺癌等,表明Gab2可能为一种新的致癌基因。而随着对microRNAs的研究发现:在细胞分化及疾病发生发展过程中起重要调控作用。关于Gab2在肾癌方面的研究目前尚少,故本实验旨在研究Gab2（Grb2相关的连接蛋白2）在肾细胞癌（RCC）细胞的表达和生物学特性;探索microRNA-302c-3p靶向调控Gab2的作用。从而为临床治疗肾癌提供新的思路。材料与方法:1、材料1.1 RCC细胞系的培养从上海生物科学研究所细胞库获得人RCC细胞系（786-O和A489）以及HK-2肾小管上皮细胞。1.2人原代RCC细胞的培养从两例原发性RCC患者获得病变肿瘤组织（患者1,男性,54岁;患者2,男性,43岁）,患者其被南通大学第二附属医院接收,在手术前未接受任何治疗。通过胶原酶I（Sigma,0.05%w/v）温育消化切碎的RCC肿瘤组织。从而建立人原代RCC细胞系,并且分为RCC（P1）和RCC（P2）。1.3 11例肾肿瘤患者（2011-2014年收治,年龄45-73岁,其中女性5例、男性6例,肿瘤大小4.3-7.6cm）,患者其被南通大学第二附属医院接收,在手术前未接受任何治疗。1.4裸鼠荷瘤模型裸鼠20只,雌雄各10只,4-5周龄,16-18g,购自南通大学动物实验室。1.5 Gab2 shRNA:从Santa Cruz Biotech和Genepharm购买两种不同的Gab2shRNA慢病毒。1.6 Gab2 siRNA:Gab2 siRNA由Genechem公司合成。2、方法2.1检测RCC组织中Gab2和microRNA-302c-3p的表达以及Akt的活化,用实时定量PCR（qRT-PCR）测定11例人正常肾脏组织以及RCC组织中Gab2 mRNA和microRNA-302c-3p的表达,同时用Western Blotting（WB）检测蛋白质表达。2.2另外在已经构建的人RCC细胞系（786-O和A498）以及原代人RCC细胞[RCC（P1）和RCC（P2）]和HK-2管状上皮细胞中同样利用qRT-PCR和WB法分别测定Gab2 mRNA和microRNA-302c-3p的表达和蛋白质表达以及Akt的活化。2.3 shRNA干扰786-O RCC细胞系中Gab2,用qRT-PCR和WB法测定Gab2mRNA的表达和Akt活化,并且用MTT法、细胞集落实验（Clonogenicity assay）以及BrdU ELISA检测细胞增殖。2.4过表达786-O RCC细胞系中Gab2,用上述方法检测Gab2和Akt的表达及细胞增殖。2.5 siRNA干扰人原代培养的RCC细胞中Gab2的表达,并检测细胞增殖。2.6在786-O RCC细胞系中外源性过表达microRNA-302c-3p后测定Gab2表达以及细胞增殖,同时在786-O RCC细胞系中过表达Antagomi R-302c后测定Gab2表达和Akt活化以及细胞增殖。2.7裸鼠荷瘤模型,裸鼠20只,雌雄各10只,4-5周龄,16-18g,随机分成两组,每组各10只。将相同数量（每只小鼠5×10 6个）的miR-302c过表达的和miR-C表达的对照786-O细胞和分别注射到两组裸鼠构建裸鼠荷瘤模型。在三周内,建立肿瘤移植瘤模型,肿瘤体积为约100mm3,开始每日密切观察裸鼠并做好实验记录。每7天进行小鼠体重和双向肿瘤测量,计算肿瘤体积。研究结果:1.首先,本课题通过目标测序发现miR-302c-3p和Gab2 mRNA 3’非翻译区（3’-UTR）（位置125-131）特异性的结合;其次,对比正常肾脏组织,在RCC组织和细胞中,Gab2mRNA的表达明显上调,而miR-302c-3p的表达明显下调,同时miR-302c-3p的表达与Gab2的表达呈负相关。2.在RCC组织中,采用RNA干扰的方法可以有效的下调Gab2的表达,并抑制Akt活性,进而抑制细胞增值。反之,采用质粒转染的方法可以有效的上调Gab2的表达,并增加Akt活性,进而增加细胞增值。3.在786-O RCC细胞系中外源性过表达micro RNA-302c-3p后,发现Gab2mRNA的表达明显下调,Akt活性以及细胞增殖受到抑制;而将反义microRNA-302c（AntagomiR-302c）在786-O RCC细胞系中过表达后发现microRNA-302c-3p表达下调,同时Gab2mRNA的表达升高,Akt活性上调以及细胞增殖。另外,用sh RNA干扰786-O RCC细胞系中Gab2的表达后,再外源性过表达microRNA-302c-3p,Akt活性以及细胞增殖没有受到抑制。另外,裸鼠成瘤实验显示:外源性过表达miR-302c-3p抑制786-O肿瘤在体生长结论:1.对比正常肾脏组织,在RCC组织和细胞中,Gab2m RNA的表达明显上调,而miR-302c-3p的表达明显下调,同时miR-302c-3p的表达与Gab2的表达呈负相关。2.在RCC组织中下调Gab2的表达,可以抑制Akt活性,并抑制细胞增值。反之,上调Gab2的表达可以增加Akt活性,并增加细胞增值。3.在人RCC细胞,Gab2是microRNA-302c-3p的靶蛋白,microRNA-302c-3p可以反向调控Gab2;外源性过表达miR-302c-3p抑制786-O肿瘤在体内生长。