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目的:心肌肥厚是心肌工作超负荷的一种适应性反应,是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立的危险因素。本实验通过缩窄大鼠腹主动脉建立心肌肥厚模型,研究心肌组织内皮素转化酶-1(ECE-1)及其各个亚型的变化情况。并针对各个亚型特异性肽段,使用免疫多肽片断-KLH蛋白偶联法制备针对各亚型的多克隆抗体,并初步检测抗体的效价和特异性。
方法:采用大鼠腹主动脉缩窄法建立心肌肥厚模型。健康SD大鼠随机分为六组:①假手术组2周(n=8),②腹主动脉缩窄组2周,③假手术组4周(n=8)④腹主动脉缩窄组4周(n=12),⑤假手术组6周(n=8),⑥腹主动脉缩窄组6周(n=12)。测定血压,血流动力学指标,超声心动图以及心肌组织ANP表达量等以确定心肌肥厚模型的成功建立,RT-RCR及western法分别测量ECE-1的表达量,RT-PCR法测量四种亚型在肥厚心肌组织中的表达差异。同时测量各组心肌组织中前原内皮素-1(RT-PCR)和内皮素-1(ELISA)的含量,从而间接反应内皮素转化酶-1的活性。
人工合成针对各亚型的特异性肽段,交连到马来酰亚胺活化的mcKLH蛋白上后与佐剂混合免疫家兔,获得兔抗人的亚型特异性抗血清并通过ELISA法测量抗体效价及特异性。
结果:①与对照组比较,心肌肥厚组SBP、LVMI、LVSP、IVS等都显著增高(p<0.05),光镜下见心肌细胞肥大、肌纤维增粗。②心肌肥厚组心肌组织ECE-1的表达明显增加(p<0.01),且呈现时间依赖型。③心肌肥厚组心肌组织ECE-1a,1c亚型表达较假手术组明显升高(p<0.05),而ECE-1b和1c亚型未见升高。④各实验组preproET-1表达量未见明显变化,而心肌肥厚组心肌组织中内皮素-1的表达量较假手术组明显升高(p<0.05)。⑤获得兔抗人ECE-1a,1b,1d和抗ECE-1bcd抗血清,间接ELISA测定抗体滴度≥1:5000,并有良好的特异性。结论①压力超负荷心肌肥厚大鼠ECE-1表达明显增加,加速内皮素-1的产生,促进大鼠心肌肥厚的发生发展。②心肌肥厚过程中内皮素转化酶-1的表达增加可能主要是由a亚型和c亚型在心肌组织中的表达上调所引起的。③利用蛋白质多参数综合分析软件通过蛋白氨基酸序列预测蛋白抗原表位序列是可行的,所筛选的表位序列可以用于制备ECE-1亚型特异性的抗原肽抗体。④利用免疫多肽片断+载体蛋白的方法制备ECE-1亚型特异性抗体是可行的,本实验所制备的免疫多肽和mcKLH偶联产物具有免疫原性。