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背景:双香叶酰化是细胞内一种重要的蛋白质修饰方式。多种细胞内信号分子需经双香叶酰化修饰后方能发挥其在细胞增殖、分化、迁移及存活等方面的生物学功能。双香叶酰化介导的蛋白质修饰过程已被证明在肿瘤的发生发展中起重要作用,但目前其促肿瘤作用的机理及信号途径仍不清楚。目的:本课题以胃癌以及三阴性乳腺癌为研究系统,着重探讨双香叶酰化信号对促癌蛋白YAP/TAZ的调控作用,确定双香叶酰化-YAP/TAZ信号通路对肿瘤生长、转移及浸润的促进效应,揭示双香叶酰化-YAP/TAZ信号通路激活肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的内在机制。同时鉴定胃癌及三阴性乳腺癌诊断和治疗的新型分子靶标,为临床开发新的靶向治疗药物以及为肿瘤患者预后预测等提供理论依据。方法:1、用阿托伐他汀(Atorvastatin,简称AT)、双香叶酰基转移酶I抑制剂(GGTI-298)处理细胞以抑制细胞内双香叶酰化信号,同时加入香叶基香叶醇(GGOH)以恢复双香叶酰化信号。2、用慢病毒表达系统在三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞和胃癌AGS细胞中构建YAP1、TAZ、CYR61、E2F1等基因敲低的细胞株。3、对于不同处理组细胞与不同敲低细胞株,用细胞计数法测定细胞增殖速度;用细胞划痕与Transwell迁移分析方法测定细胞迁移能力;用Transwell侵袭分析方法测定细胞侵袭能力;用免疫荧光染色观察和测定细胞内相关基因表达及亚细胞定位状况;用常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR方法检测相关基因的mRNA表达量;以及用Western Blotting方法检测相关蛋白的表达量。4、用微管抑制剂诺考达唑(Nocodazole)处理细胞实现细胞周期同步化;用诺考达唑释放实验(Nocodazole Release)检测细胞周期进展;用DAPI与Hoechst等DNA荧光染料显示细胞核及检测细胞有丝分裂状态。5、将214例胃贲门癌组织与癌旁正常组织制成组织芯片,并用免疫组化技术检测组织芯片中YAP/TAZ靶基因产物CYR61的表达量。收集相应贲门癌患者病理资料,结合免疫组化染色结果,用Kaplan-Meier法分析CYR61表达量与患者生存期相关性;用COX多因素回归法分析TNM分期、肿瘤浸润情况(T分级)、淋巴结转移情况(N分级)、肿瘤大小、分化情况、CYR61表达量与患者生存期相关性;用卡方检验分析CYR61表达与多种临床病理变量之间的相关性。结果:1、抑制双香叶酰化可显著抑制胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭以及抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞增殖,表明胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭依赖于双香叶酰化信号并且三阴性乳腺癌细胞的增殖依赖于双香叶酰化信号。2、抑制双香叶酰化可导致胃癌AGS细胞内YAP/TAZ的靶基因CYR61和CTGF的表达显著下调,表明YAP/TAZ是双香叶酰化信号的下游效应分子。同时,敲低YAP1或TAZ的表达可显著抑制胃癌AGS细胞或三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭,进一步表明YAP/TAZ是介导双香叶酰化调控肿瘤细胞生长、迁移和侵袭能力的下游效应分子。3、抑制双香叶酰化可阻碍胃癌AGS细胞及三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞内YAP1和TAZ的细胞核转运,表明双香叶酰化信号是YAP/TAZ的激活信号。4、抑制双香叶酰化与敲低YAP1均可抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞有丝分裂,表明三阴性乳腺癌细胞的有丝分裂依赖于双香叶酰化激活的YAP信号通路。5、抑制双香叶酰化与敲低YAP1均能下调三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞内着丝粒相关基因及转录因子基因E2F1的表达,但敲低TAZ对着丝粒相关基因的表达无显著影响。敲低E2F1能够抑制MDA-MB-231细胞增殖及胞内着丝粒相关基因表达。这些结果表明双香叶酰化激活的YAP信号通路介导E2F1刺激着丝粒相关基因转录,从而促进三阴性乳腺癌细胞增殖。6、YAP/TAZ的靶基因产物CYR61在贲门癌组织中过表达,且CYR61的过表达与贲门癌肿瘤TNM分期和N分级呈显著正相关,与患者累积生存时间呈显著负相关。而贲门癌肿瘤组织TNM分期和N分级又与患者生存时间呈显著负相关。这些结果表明CYR61可能参与贲门癌转移,是贲门癌患者生存时间短和预后差的原因之一。因此,CYR61表达可作为贲门癌预后预测的一个检测指标。7、敲低CYR61或阻断双香叶酰化信号均抑制AGS细胞的迁移,但敲低CYR61不影响AGS细胞的增殖。这些结果表明CYR61主要参与双香叶酰化激活的YAP信号通路所介导的贲门癌转移过程。结论:双香叶酰化信号激活YAP/TAZ通路促进胃癌及三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及贲门癌的转移及浸润。其分子机制是活化的YAP1通过上调转录因子E2F1的表达从而激活着丝粒相关基因的转录,以此促进三阴性乳腺癌细胞增殖。同时,双香叶酰化信号激活的YAP/TAZ通过提高其靶基因产物CYR61的表达而促进胃癌细胞的迁移和侵袭。