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目的本课题以前期采用阿霉素大剂量间隙干预的方法成功建立的骨肉瘤阿霉素耐药株MG63/ADM细胞为研究对象,观察PTEN、p-Akt、Akt在MG63/ADM细胞中的表达,通过体外实验观察片仔癀对骨肉瘤MG63/ADM细胞增殖、凋亡的作用,及对PTEN、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达的影响,进而深入剖析片仔癀对骨肉瘤耐药细胞增殖抑制作用与PI3K/Akt信号通路的关系,进一步为临床治疗骨肉瘤提供理论基础。方法:1、PTEN、Akt、p-Akt蛋白在MG63/ADM细胞中的表达。以成功建立的骨肉瘤阿霉素耐药株MG63/ADM细胞为研究对象,采用Western blot方法检测PTEN、Akt、p-Akt蛋白在MG63/ADM细胞中的表达情况。2、片仔癀对MG63/ADM细胞的作用及对PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响。采用MTT法检测不同浓度、不同作用时间的片仔癀对MG63/ADM细胞增殖的影响;Hoechst 33342染色荧光显微镜下观察片仔癀对MG63/ADM细胞凋亡的影响;Western blot法观察片仔癀作用后MG63/ADM细胞中PTEN、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved-PARP蛋白的表达。结果:1、Western blot结果表明,PTEN在MG63/ADM细胞中的表达明显低于MG63细胞,p-Akt蛋白在MG63/ADM细胞中呈高表达,与MG63细胞之间有显著差异性(P<0.05);Akt蛋白在两者间的表达差异不明显。说明MG63/ADM细胞的耐药性可能与PTEN表达下调,Akt的磷酸化水平提高有关。2、MTT结果示片仔癀能明显抑制MG63/ADM细胞的增殖,相同干预浓度下,细胞增殖抑制率随作用时间延长而增加;在相同干预时间情况下,细胞增殖抑制率随片仔癀浓度的增高而增加;与对照组之间有显著的差异(P<0.01)。说明片仔癀对MG63/ADM细胞的增殖抑制作用与片仔癀浓度与干预时间相关。3、不同浓度片仔癀作用MG63/ADM细胞48h,荧光显微镜下观察Hoechst33342染色后MG63/ADM细胞核的形态变化,可见对照组细胞核表现为椭圆形的蓝色均匀荧光,片仔癀组则出现细胞核聚缩,月牙状改变等凋亡的表现,尤其是1.2mg/mL组细胞数量明显减少,剩余细胞的细胞核出现典型的凋亡小体。说明片仔癀可明显促进MG63/ADM细胞凋亡。4、Western Blot结果表明,片仔癀干预MG63/ADM细胞48h后,PTEN表达水平随着片仔癀浓度增大而增加;Akt蛋白的表达水平变化不明显;p-Akt表达水平随片仔癀浓度的增大而减少;PARP蛋白的表达有下降;Cleaved-PARP表达水平随片仔癀浓度增大而增加,说明片仔癀可促进PARP的裂解。PTEN、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达量与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示片仔癀可上调PTEN的表达,抑制Akt蛋白的磷酸化(p-Akt)水平,促进PARP蛋白裂解,Cleaved-PARP表达明显上调,促进了 MG63/ADM细胞的凋亡。结论1、骨肉瘤耐药性与PI3K/Akt信号通路的异常表达相关,表现为PTEN蛋白表达抑制,Akt蛋白磷酸化水平提高。2、片仔癀可通过促进MG63/ADM细胞PTEN的表达,使Akt蛋白磷酸化减少,发挥其抑制MG63/ADM细胞增殖,促进凋亡的作用。