研究背景骨肉瘤(OS)是一种高度侵袭性恶性肿瘤,在骨骼恶性肿瘤中排在首位。对于患有骨肉瘤的患者通常是致命的。对于骨肉瘤合并转移或患有骨肉瘤并已复发的患者其治疗效果更差。骨肉瘤最常侵袭肢体长骨的干骺端,最易出现在患者股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。对于25岁以上的患者则表现出更多种类的骨性位置,如锁骨、肋骨、肩胛骨、髂骨等。虽然骨肉瘤最常发生在5岁和成年早期的患者中,但发病率在老年人(>65)中再次达到峰值。骨肉瘤的隐匿性比较高常因患者的意外受伤而被发现,也可通过影像学手段进行诊断。但通过与大多数肿瘤性疾病的临床表现对比,骨肉瘤具备更强的侵袭和分散能力。骨肉瘤可扩散至机体多个骨骼和淋巴结中。可通过组合PET/CT诊断骨肉瘤和预测侵袭部位的坏死程度。当发生远处转移时,骨肉瘤在机体的转移部位可划分为肺部和肺外,最常见的部位是肺部。除去与骨肉瘤的肺部和肺外转移,骨肉瘤也可通过跳跃性转移侵袭临近骨骼。跳跃性转移也叫同步区域性骨转移,它的转移范围是局部的,但对于机体来说可能是更严重的转移性并发症。尽管可通过传统的截肢手术及术后的化疗使机体局部肿瘤得到控制,但超过80%的骨肉瘤患者在确定诊断时已产生转移。骨肉瘤未发生转移时通过手术治疗并完成正规的术后治疗,国内的5年生存率在50%上下,在治疗时已发生肺部和骨性转移时其4年生存率为0%。这也是骨肉瘤相关死亡的主要缘由。近年来在国际和国内对于骨肉瘤的研究中,多种血清标志物在骨肉瘤的诊断和骨肉瘤在机体的进展中的作用越来越得到重视。通过研究在血清各种生物标志物中碱性磷酸酶(ALP)和乳糖脱氢酶(LDH)的作用比较突出,相较于各种血清标志物碱性磷酸酶(ALP)对于骨肉瘤的诊断价值最高。尽管目前的研究发现骨肉瘤的发生发展与患者的种族、性别、年龄、遗传基因的改变及是否暴露等因素密切相关,但骨肉瘤的确切病理生理学及发生发展机制仍然不清楚。骨肉瘤的分子发病机制和遗传学是巨大且极其异质的。骨肉瘤作为原发性骨恶性肿瘤其发病机制是极其复杂的,所以要想实现对骨肉瘤的确切诊断必须要通过综合多学科方法联合研究。磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN):是一种具有双磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,PTEN功能的丧失导致PI3K-AKT(磷酸肌醇3-激酶-RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)途径的激活,这使得PTEN可作为在临床局限性肿瘤患者中区分惰性和侵袭性疾病的潜在有用的肿瘤标记物。为了能用PTEN的状态来作为预测肿瘤和肿瘤预后和的生物学标志物,目前已经开发了经过分析验证的测定法,此方法可靠且可重复地检测肿瘤组织和血液组织中的PTEN损失。在肿瘤组织中使用临床分级分析已显示PTEN及其蛋白质的丢失之间的强烈相关性以及PTEN丧失与不良病理特征和肿瘤学结果之间的强关联。在晚期疾病中,评估液体活组织检查中的PTEN状态可预测肿瘤对靶向治疗的反应。最后,研究表明PTEN可能具有PI3K-AKT途径以外的其他功能,包括通过调节免疫应答和肿瘤微环境影响肿瘤生长的功能。近年来,PTEN作为代谢调节剂的功能引起了人们的极大关注。微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA(长度约22nt),被称为真核基因表达的有效主要调节物。目前研究已经证明miRNA在多种癌症发病中起关键作用,并且miRNA的错误调节是癌症的众所周知的特征。近年来,miR-29已成为在研究多种癌症时的关键miRNA,并且大量研究表明其可调节多种致癌的过程,包括表观遗传学、蛋白质稳定、代谢、增殖、凋亡、转移、纤维化、血管生成和免疫调节。尽管miR-29在大多数研究中已被记录为肿瘤抑制因子,但miR-29作为致癌基因的报道的争议仍然存在。目的本研究通过比较miR-29在骨肉瘤组织与正常组织中表达水平的差异,分析miR-29在骨肉瘤细胞增殖和转移过程中的作用。并通过实验数据验证PTEN在miR-29促进骨肉瘤细胞增殖和转移过程中所起到的作用,并剖析其与临床病例参数的关系,为以PTEN作用为根基的骨肉瘤的免疫治疗提供新思路。方法搜集来自郑州大学第一附属医院成人骨科以及小儿骨科于2010年2月至2016年8月收治接受骨肉瘤切除手术并且病理诊断明确的60例骨肉瘤患者的骨肉瘤组织及相邻的非癌组织,征得骨肉瘤患者及家属批准,并且患者家属在患者做骨肉瘤切除手术前签订了手术知情同意书。目的是为了确保在实验中所有参与研究的骨肉瘤患者均需排除患有骨肉瘤以外的任何其他系统肿瘤。且所有骨肉瘤患者在手术前均未接受放疗或化疗。收集这些患者手术当曰术中取下的骨肉瘤组织及癌旁未被侵犯的正常组织,所有新鲜手术标本切除后均用生理盐水冲洗干净后立即置于液氮中并在-80℃下在制冷剂中储存,用于随后的实验。将购买的OS细胞系(MG-63,U2OS,143B,Saos-2)在含有RPMI-1640培养基中设置温度为37℃进行培养,用于随后的实验。通过使用RT-qPCR检测OS组织和细胞中的miR-29水平。通过MTT测定和RT-qPCR测量细胞增殖。结果使用RT-qPCR实验方法检测骨肉瘤组织和细胞及正常组织中的miR-29水平。结果显示骨肉瘤癌组织中miR-29的平均水平显着增加。两组差别相比具有统计学意义(P<0.05),与正常细胞(hFOB1.19)相比,骨肉瘤细胞(MG-63,U2OS,143B,Saos-2)中的miR-29表达也升高,两组差异比较具有统计学意义(P<O.05),这意味着miR-29在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中过表达。另外通过MTT测定和RT-qPCR测量细胞增殖。MTT结果显示,与对照模拟组比较,miR-29模拟组中的细胞活力增强。RT-qPCR分析发现miR-29模拟组中PCNA(细胞增殖的标志物)的表达增加。Transwell测量的细胞迁移证明miR-29模拟物促进骨肉瘤细胞的迁移能力,上述实验结果表明miR-29分子对骨肉瘤细胞的增殖具有促进作用。提示miR-29可能对骨肉瘤的进展有重要意义。通过运用蛋白质印迹分析和RT-qPCR评估了在MG-63细胞中当恢复或抑制miR-29的PTEN蛋白和mRNA水平来检测PTEN对于骨肉瘤的作用。当miR-29恢复时PTEN表达降低,而当抑制miR-29时PTEN表达增加。提示miR-29和PTEN表达呈负相关。将miR-29模拟物和PTEN载体共同转染到MG-63细胞中以测试PTEN在由miR-29调节骨肉瘤细胞中的作用。结果显示PTEN可以逆转miR-29的促进作用。总之,miR-29可以促进OS细胞迁移和增殖并靶向PTEN。结论miR-29在骨肉瘤癌组织中表达水平升高,且在骨肉瘤中miR-29和PTEN的表达呈负相关。PTEN过表达被证实可抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移,PTEN也可逆转miR-29对骨肉瘤进展的促进作用。miR-29可以负调节MG63细胞中PTEN的表达。表明miR-29可能在骨肉瘤产生、发展、转移和患者存活中发挥非常重要的作用,可为以PTEN的表达为根基的骨肉瘤的免疫治疗提供一定的理论基础。