团头鲂源嗜水气单胞菌分离鉴定、检测及绿色荧光蛋白标记菌株的构建

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团头鲂(Megalobrama amblycephala),俗称武昌鱼,是全国推广的淡水养殖优良品种,由于集约化养殖技术的发展,现在养殖密度越来越高,导致生态环境恶化,各种病害接踵而至,并呈现大规模暴发和流行的趋势,给团头鲂养殖业带来了严重的经济损失。2011年江苏省常州市武进区养殖的团头鲂出现大量死亡,病鱼主要表现为行动缓慢,摄食量少,浮头,鱼体表出血严重。从患病的团头鲂肝脏中分离得1株优势菌记为WJ-8。将菌WJ-8进行人工回感试验,其患病症状同自然发病症状,证明其对团头鲂有致病性。该菌的形态特征、主要理化特性、16S rRNA序列测定结果及系统发育树的构建表明该菌株为嗜水气单胞菌。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考、甲哌利福霉素、链霉素、卡那霉素等21种药物敏感,对青霉素、氨苄西林、羧苄青霉素、苯唑西林等12种药物表现出耐药性。运用石蜡包埋及组织切片技术对发病团头鲂以及健康团头鲂的肝脏、肾脏以及脾脏三种组织进行了病理学研究,病症主要表现为:三种组织中均有部分细胞核固缩或肿胀,细胞破损、坏死,肾脏以及脾脏组织中有铁血黄素沉着。根据GenBank收录的细胞兴奋性肠毒素(alt)基因和气溶素结构基因(aerA),依据嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)保守序列分别设计能检测alt和aerA基因的特异性引物,并进行PCR反应体系和反应条件的优化。建立了一种快速检测嗜水气单胞菌双重PCR方法。结果显示,在同一PCR反应体系中,供试菌株嗜水气单胞菌扩增2条目的条带,扩增产物的片段大小分别为200bp和280bp,而对照菌株温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、(?)鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、河流弧菌(Vibrio fluxialis)勺PCR扩增则没有条带检出。敏感性试验结果显示,该双重PCR最低能检测3×104CFU/mL菌体浓度的嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌模板DNA的检出极限为49fg/μL;对嗜水气单胞菌的强毒株、弱毒株以及无毒株也进行了试验,发现强毒株以及弱毒株有目的条带;同时对送检的患病水产品进行抽检,检测出阳性结果的样品均可分离到优势生长的嗜水气单胞菌。结果证实,试验所建立的基于2种基因的双重PCR方法快捷、灵敏,为今后由于该菌所引起的水产动物疾病的检测提供了参考依据。利用生产中常用的10种药物分别进行了其对分离菌的MIC以及MBC测定,试验结果表明盐酸金霉素对分离菌株的抑菌效果以及杀菌效果最好,分别为2μg/mL、4μg/mL;其次为氟苯尼考、恩诺沙星以及硫酸链霉素,这3种抗菌药物的最小抑菌浓度以及最小杀菌浓度均小于10μg/mL.实验以绿色荧光蛋白质粒pEGFPuv (Clontech)为基础,通过抗性基因改造构建了荧光粒pEGFPuv-Kar。通过电击转化法成功导入到嗜水气单胞菌株WJ-8中并且得以表达。质粒在嗜水气单胞菌WJ-8中的稳定性检测结果显示直至接种第12次质粒稳定性为100%,至第21次,质粒稳定性降为5%。WJ-8GFP的人工回感试验结果与WJ-8的人工回感试验相一致,表明将绿色荧光蛋白基因质粒导入嗜水气单胞菌中没有降低其致病力。利用绿色荧光蛋白基因标记的嗜水气单胞菌WJ-8GFP对团头鲂进行腹腔注射,观察其在6h、12h、24h、36h、48h时间段内在团头鲂各组织中的分布情况,发现脾肾为主要的侵染器官,其中肾脏遭受攻击最为严重;菌株WJ-8GFP在12h时对各组织器官的侵染达到最高峰。
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