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植物离体器官诱导是目前植物干细胞领域的一个研究热点,指植物外植体材料(包括根、下胚轴、子叶及种子等)在适宜的离体培养环境中诱导离体苗、根等器官形成的生物学过程。目前,植物离体器官的再生体系相对成熟,一般包括愈伤组织形成和离体苗分化两个过程。研究人员在此基础上发掘了一些调控愈伤组织形成和离体器官再生的相关基因,然而离体器官再生的调控机制仍不清楚,尤其是表观遗传调控子在植物离体器官再生中的功能有待系统研究。MicroRNAs (miRNAs)作为小分子非编码RNA,主要通过转录后水平剪切抑制靶基因的表达或翻译,进而表观调控植物的形态建成及逆境胁迫响应等生物学过程。目前,部分研究揭示了 miRNAs参与调控植物的离体苗再生,进而揭开了植物离体器官再生过程中miRNAs的功能研究,因而,为了解析miRNAs在离体苗再生中的调控机制,更多的功能miRNAs有待挖掘。本实验室前期通过分析拟南芥胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织miRNAs的表达谱芯片,发现miR159、miR165/6在两类愈伤组织中表达差异明显,推测其在离体苗再生中起作用。本论文利用mir159ab双突变体材料,分析了miR159在离体苗诱导过程中的功能,并进一步明确了miR159调控愈伤组织形成和离体苗再生过程中的靶基因。鉴于离体器官诱导所用外植体为拟南芥的根,因而进一步开展了miR159对拟南芥主根生长及根尖分生组织区发育的调控研究。另外,miRNAs对靶基因的表观调控离不开AGO家族蛋白的参与,而AGO10可与AGO1竞争结合miR165/6进而减少沉默复合体的形成,因此本论文拟开展miR165/6及其调控子AGO10在离体苗诱导过程中的功能,并对其调控离体苗再生的机制进行了初步研究。主要研究结果如下:1) mir159ab双突变体根外植体形成的愈伤组织团数目明显增多,Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的CIM培养物中表达均显著提升。通过比较pMYB65:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植体在CIM培养阶段的GFP信号,发现mir159ab×pMYB65:159-GFP外植体诱导的愈伤组织中GFP信号显著增强,进一步证明了愈伤组织形成过程中miR159对MYB65表达的抑制模式。分析MYB65的抗剪切系pMYB65:mMYB65及myb33myb65myb101三突变体的愈伤组织形成能力,发现pMYB65:mMYB65形成的愈伤组织团数目显著提升,而myb33myb65myb101三突变体形成的愈伤组织数目明显减少。结果表明miR159通过抑制靶基因MYB33、MYB65和MYB101的表达抑制CIM阶段愈伤组织的形成。2) mir159ab双突变体根外植体离体苗分化的数目明显减少,Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab的SIM培养物中的表达均显著提升。通过比较pMYB65:159-GFP和mir159ab×pMYB65:159-GFP株系外植体在SIM培养4-10 d的GFP信号,发现mir159ab×pMYB65:159-GFP外植体形成的细胞团中GFP信号显著增强,进一步证明了离体苗再生过程中miR159对MYB65表达的抑制模式。分析pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65、pMYB101:mMYB101(靶基因MYB33/65/101的抗剪切系)及myb33myb65myb101三突变体的离体苗再生表型,发现3个靶基因的抗剪切系的离体苗再生数目均显著减少,而靶基因的三突变体的离体苗再生数目未见显著变化,表明MYB33、MYB65和MYB101均抑制离体苗的再生。Real-time PCR分析表明,WUS、CLV3和STM在pMYB65:mMYB65系SIM培养物中的表达均显著降低。GFP信号检测表明pTCSn:GFP信号在pMYB65:mMYB65系SIM培养物中减弱,而pDR5:GFP信号增强。上述结果表明miR159为离体苗再生的促进子,通过抑制靶基因(MYB33、MYB65和MYB101)的表达,进而促进WUS、CLV3和STM的表达和细胞分裂素的响应并降低生长素信号响应实现对离体苗再生的表观调控。3 )mir159ab双突变体的主根长度及其根尖分生组织区大小显著高于野生型。Real-time PCR分析表明,MYB33、MYB65和MYB101在mir159ab主根中的表达量显著增强,同时pMYB33:mMYB33、pMYB65:mMYB65和pMYB101:mMYB101系的主根长度明显增加,表明miR159通过抑制靶基因的表达进而抑制拟南芥主根的生长。通过检测pMYB65:mMYB65×pCYCB1;1:GUS 、pMYB65:mMYB65×pPIN1:PIN1-GFP 、 pMYB65:mMYB65×pWOX5:GFP 、pMYB65:mMYB65×pPLT1:PLT1-GFP 和 pMYB65:mMYB65×pSCR:GFP株系的GUS及GFP信号,发现MYB65促进CYCB1;1的表达,EMSA实验进一步证明MYB65可直接结合促进CYCB1;1基因的表达进而促进根尖分生组织区细胞的分裂,并促进主根的生长。4)利用实验室建立的成熟种子的液体诱导体系分析了 AGO10在离体苗再生中的功能。发现p35S:AGO10离体苗再生比率低于野生型,而ago10(功能缺失突变体)离体苗再生比率显著升高,同时p35S:AGO10转化ago10可明显降低其离体苗再生频率,表明AGO10为离体苗再生的抑制子。通过观察离体苗再生过程中pAGO10:GUS及pAGO10:GFP报告基因的信号,发现AGO10表达于形成的突起结构及原分生组织(pro-SAM)的起始部位。通过比较离体苗再生过程中,pU2:MIR165/6-GFP在野生型与ago10中的GFP信号,发现ago10×pU2:MIR165/6-GFP的培养物中GFP信号显著降低,表明miR165/6在ago10中的表达明显增强。RNA原位杂交结果显示,AGO10表达部位集中于突起结构的pro-SAM部位,并与miR165/6的表达部位重叠,抑制miR165/6的表达,从而促进 HD-ZIPⅢ的表达。分析MIM165/6 (artificial miR165/6 target mimics)及men1(miR166a-ox)的离体苗再生表型,发现MIM165/166的离体苗再生频率降低而men1的离体苗再生频率增高,表明miR165/166为离体苗再生的促进子。进一步分析ago10×MIM165/6杂交系的表型,发现ago10×MIM165/6的离体苗再生数目显著低于ago10外植体分化的离体苗数但高于MIM165/6的再生数,表明AGO10可能部分通过抑制miR165/6成熟体的表达进而抑制离体苗的再生。综上,本论文鉴定了表观遗传调控子miR159和miR165/6及其调控子AGO10在离体苗再生过程中的功能,并对其调控离体苗再生的分子机制做了初步研究,为进一步深入解析表观遗传调控植物离体再生的机理奠定了基础。