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背景
脑卒中是全球第二大死亡原因，是中国人的首位死亡原因。其最主要的类型是动脉阻塞引起的急性缺血性脑卒中(AIS)。血管再通，即静脉溶栓和血管内血栓切除术，是目前临床上仅有的治疗AIS有效的手段，但治疗时间窗短，且再灌注后易引起血脑屏障破坏、再出血、水肿加剧等，使脑组织病理损伤的程度进一步加重，称为缺血再灌注损伤。因此，进一步研究AIS导致脑损伤的机制，探寻新的治疗靶点，研发新药，是目前亟待解决的问题。
AIS损伤涉及复杂的病理生理学过程与分子机制，包括氧/硝化应激、兴奋性谷氨酸毒性、炎症反应、细胞凋亡和坏死、肠道菌群紊乱等，其中炎症反应是其关键机制之一。研究表明，脑组织缺血缺氧后，大量释放高迁移率族蛋白B1(HMGB1)，结合细胞膜上的晚期糖基化终产物受体(RAGE)和Toll样受体2/4(TLR2/4)，进而激活下游炎症反应，导致炎症因子释放，进一步加重脑组织炎症反应。
小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，负责局部免疫监视与稳态调控，表达Toll样受体(TLR)和Nod样受体(NLR)，以感知病原体或损伤信号、吞噬细胞碎片，是脑炎症反应最主要的引发者与参与者。AIS发生后，在外周巨噬细胞浸润脑组织之前，小胶质细胞就已经开始活化，吞噬受损或坏死的神经细胞。进一步研究小胶质细胞在AIS中的调控作用及机制，有助于寻找新的AIS治疗治疗靶点并研发新药。
尿酸是最主要的内源性抗氧化剂，具有抗炎抗氧化作用。已有的临床研究和基础研究表明，尿酸有望应用于急性缺血性脑卒中的治疗，但其具体的抗炎机制尚不明确。尿酸是否可以通过抑制小胶质细胞HMGB1的分泌而抑制缺血再灌注引起的炎症因子分泌则需进一步研究。
目的
探究尿酸是否通过抑制HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路缓解小鼠小胶质细胞系BV2细胞氧糖剥夺/复氧带来的损伤；同时利用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型验证尿酸在体内缓解急性缺血性脑卒中的作用，以期为尿酸的临床应用提供进一步的理论基础。
研究方法
1.常规培养BV2细胞。使用无糖不含血清DMEM培养基，于含5%CO2、94%N2、1%O2的无氧培养箱中缺氧5h，再使用DMEM完全培养基于正常培养箱中复氧20h，以构建OGD/R模型。
2.设对照(CTRL)组、OGD/R组、OGD/R+GLY(甘草酸，HMGB1抑制剂)组、OGD/R+TAK(TAK-242,TLR4抑制剂)组、OGD/R+BAY(BAY11-7085，NF-κB抑制剂)组，蛋白免疫印迹方法检测HMGB1、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达，ELISA检测细胞上清HMGB1蛋白与炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的含量。
3.设对照(CTRL)组、OGD/R组、OGD/R+100μM尿酸组、OGD/R+200μM尿酸组、OGD/R+300μM尿酸组、300μM尿酸组。尿酸于复氧时开始加入，复氧/尿酸共孵育时间为20h或12h。噻唑蓝比色法(MTT assay)、乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞活性；实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)法检测HMGB1、NF-κBp65、TNF-α、IL1β、IL6的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹方法研究HMGB1、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达，ELISA检测细胞上清HMGB1蛋白及炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的浓度。
4.设对照(CTRL)组、OGD/R组、OGD/R+UA(尿酸，300μM)组、OGD/R+UA+PROB(丙磺舒，URAT1与GLUT9抑制剂)、OGD/R+PROB组、PROB组，蛋白免疫印迹方法检测HMGB1、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达，ELISA检测细胞上清HMGB1蛋白与炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的含量。
5.建立小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，使用TTC染色、磁共振成像(MRI)、HE染色、免疫荧光染色等方法研究尿酸对小鼠脑损伤程度的影响。
结果
1.OGD/R处理显著增加了HMGB1、TLR4、NF-κBp65蛋白的表达量，促进HMGB1出核、释放至胞外，促进NF-κBp65入核，显著提高了细胞上清TNF-α、IL1β、IL6的含量，而GLY、TAK-242、BAY11-7085预处理均可显著抑制该过程。
2.尿酸可以恢复BV2细胞因OGD/R引起的活力下降，抑制HMGB1、NF-κBp65、TNF-α、IL1β、IL6的mRNA水平，抑制HMGB1的表达、出核与分泌，抑制TLR4的表达，抑制NF-κBp65入核，抑制炎症因子TNF-α、IL1β、IL6分泌。
3.OGD/R损伤激活BV2细胞HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，促进炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的释放，尿酸可以抑制该过程，而丙磺舒则抵消了尿酸的这些作用。
4.TTC染色与MRI均显示，尿酸减少MCAO模型小鼠的脑梗死面积；HE染色表明尿酸改善MCAO模型小鼠的脑组织病理改变；免疫荧光提示尿酸抑制MCAO模型小鼠脑皮质小胶质细胞的活化。
结论
尿酸通过抑制小胶质细胞HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，抑制炎症因子的释放与细胞活力的下降，缓解小胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤。这可能是尿酸保护大脑中动脉阻塞/再灌注小鼠脑损伤的分子机制之一。
脑卒中是全球第二大死亡原因，是中国人的首位死亡原因。其最主要的类型是动脉阻塞引起的急性缺血性脑卒中(AIS)。血管再通，即静脉溶栓和血管内血栓切除术，是目前临床上仅有的治疗AIS有效的手段，但治疗时间窗短，且再灌注后易引起血脑屏障破坏、再出血、水肿加剧等，使脑组织病理损伤的程度进一步加重，称为缺血再灌注损伤。因此，进一步研究AIS导致脑损伤的机制，探寻新的治疗靶点，研发新药，是目前亟待解决的问题。
AIS损伤涉及复杂的病理生理学过程与分子机制，包括氧/硝化应激、兴奋性谷氨酸毒性、炎症反应、细胞凋亡和坏死、肠道菌群紊乱等，其中炎症反应是其关键机制之一。研究表明，脑组织缺血缺氧后，大量释放高迁移率族蛋白B1(HMGB1)，结合细胞膜上的晚期糖基化终产物受体(RAGE)和Toll样受体2/4(TLR2/4)，进而激活下游炎症反应，导致炎症因子释放，进一步加重脑组织炎症反应。
小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，负责局部免疫监视与稳态调控，表达Toll样受体(TLR)和Nod样受体(NLR)，以感知病原体或损伤信号、吞噬细胞碎片，是脑炎症反应最主要的引发者与参与者。AIS发生后，在外周巨噬细胞浸润脑组织之前，小胶质细胞就已经开始活化，吞噬受损或坏死的神经细胞。进一步研究小胶质细胞在AIS中的调控作用及机制，有助于寻找新的AIS治疗治疗靶点并研发新药。
尿酸是最主要的内源性抗氧化剂，具有抗炎抗氧化作用。已有的临床研究和基础研究表明，尿酸有望应用于急性缺血性脑卒中的治疗，但其具体的抗炎机制尚不明确。尿酸是否可以通过抑制小胶质细胞HMGB1的分泌而抑制缺血再灌注引起的炎症因子分泌则需进一步研究。
目的
探究尿酸是否通过抑制HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路缓解小鼠小胶质细胞系BV2细胞氧糖剥夺/复氧带来的损伤；同时利用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型验证尿酸在体内缓解急性缺血性脑卒中的作用，以期为尿酸的临床应用提供进一步的理论基础。
研究方法
1.常规培养BV2细胞。使用无糖不含血清DMEM培养基，于含5%CO2、94%N2、1%O2的无氧培养箱中缺氧5h，再使用DMEM完全培养基于正常培养箱中复氧20h，以构建OGD/R模型。
2.设对照(CTRL)组、OGD/R组、OGD/R+GLY(甘草酸，HMGB1抑制剂)组、OGD/R+TAK(TAK-242,TLR4抑制剂)组、OGD/R+BAY(BAY11-7085，NF-κB抑制剂)组，蛋白免疫印迹方法检测HMGB1、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达，ELISA检测细胞上清HMGB1蛋白与炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的含量。
3.设对照(CTRL)组、OGD/R组、OGD/R+100μM尿酸组、OGD/R+200μM尿酸组、OGD/R+300μM尿酸组、300μM尿酸组。尿酸于复氧时开始加入，复氧/尿酸共孵育时间为20h或12h。噻唑蓝比色法(MTT assay)、乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞活性；实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)法检测HMGB1、NF-κBp65、TNF-α、IL1β、IL6的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹方法研究HMGB1、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达，ELISA检测细胞上清HMGB1蛋白及炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的浓度。
4.设对照(CTRL)组、OGD/R组、OGD/R+UA(尿酸，300μM)组、OGD/R+UA+PROB(丙磺舒，URAT1与GLUT9抑制剂)、OGD/R+PROB组、PROB组，蛋白免疫印迹方法检测HMGB1、TLR4、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达，ELISA检测细胞上清HMGB1蛋白与炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的含量。
5.建立小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，使用TTC染色、磁共振成像(MRI)、HE染色、免疫荧光染色等方法研究尿酸对小鼠脑损伤程度的影响。
结果
1.OGD/R处理显著增加了HMGB1、TLR4、NF-κBp65蛋白的表达量，促进HMGB1出核、释放至胞外，促进NF-κBp65入核，显著提高了细胞上清TNF-α、IL1β、IL6的含量，而GLY、TAK-242、BAY11-7085预处理均可显著抑制该过程。
2.尿酸可以恢复BV2细胞因OGD/R引起的活力下降，抑制HMGB1、NF-κBp65、TNF-α、IL1β、IL6的mRNA水平，抑制HMGB1的表达、出核与分泌，抑制TLR4的表达，抑制NF-κBp65入核，抑制炎症因子TNF-α、IL1β、IL6分泌。
3.OGD/R损伤激活BV2细胞HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，促进炎症因子TNF-α、IL1β、IL6的释放，尿酸可以抑制该过程，而丙磺舒则抵消了尿酸的这些作用。
4.TTC染色与MRI均显示，尿酸减少MCAO模型小鼠的脑梗死面积；HE染色表明尿酸改善MCAO模型小鼠的脑组织病理改变；免疫荧光提示尿酸抑制MCAO模型小鼠脑皮质小胶质细胞的活化。
结论
尿酸通过抑制小胶质细胞HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，抑制炎症因子的释放与细胞活力的下降，缓解小胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤。这可能是尿酸保护大脑中动脉阻塞/再灌注小鼠脑损伤的分子机制之一。