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脑胶质瘤是一种发病率和死亡率都比较高的中枢神经系统恶性肿瘤,虽然可以通过手术治疗切除,但其术后的复发率仍然非常高。为了提高治疗效果,目前临床上常规采用手术后联合放化疗为主的综合治疗措施,即便如此,胶质瘤的预后仍然不佳。当今临床治疗中面临的挑战主要为：肿瘤疾病的发生发展的机制不是非常清楚,并且肿瘤药物在治疗抗癌过程中的耐药现象比较普遍,另外现有的可以使用且安全可靠的抗癌药物种类不多。因此,为了进一步探索脑胶质瘤的相关作用机制及代谢通路,同时为胶质瘤的治疗提供新的方法和思路,我们进行了如下的研究：本实验以微小RNA(micro-RNA)作为研究核心,发现miR-136具有明显的抑癌作用,并且我们通过相关实验证明其对脑胶质瘤的生物学功能影响,进一步,我们探索研究miR-136下游可能的作用靶点,发现miR-136对下游靶基因E2F1有抑制作用,并具有调控E2F1的肿瘤细胞生物学功能的作用。最后,我们通过体外实验选择并研究了一种新颖的源自植物的单体化合物重楼皂苷D(polyphllin D, PD),该化合物对胶质瘤细胞具有诱导凋亡作用,通过观察该药物作用胶质瘤细胞时miR-136的表达水平的变化从而为miR-136的临床应用提供了可能的依据。第一部分：miR-136对胶质瘤的生物学影响目的：研究miR-136与胶质瘤恶性程度的关系,以及对胶质瘤细胞生物学特性的影响。方法：本文通过荧光定量PCR实验(qRT-PCR)对人胶质瘤组织中的miR-136表达水平进行检测统计,并研究miR-136与肿瘤病理分级之间的关系。进一步,利用qRT-PCR技术观察miR-136在各种胶质瘤细胞系细胞及正常细胞系中的表达情况。其次通过药物筛选培养方法获得胶质瘤耐顺铂细胞株U251 (U251-CDDP),然后将其与野生型U251细胞株作为对照。利用细胞转染技术加入miR-136模拟物(miR-136 mimics),用MTS法观察比较上述两种细胞系中miR-136低表达及miR-136高表达细胞系的IC50值,并绘制出细胞增殖抑制率曲线。通过划痕实验、Trans-well体外侵袭转移实验等方法观察miR-136表达水平对胶质瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响。最后,用流式细胞技术检测不同miR-136表达水平情况下胶质瘤细胞凋亡的差异和胶质瘤细胞周期的改变。从而得出miR-136高表达组与miR-136低表达组在细胞生长、侵袭,凋亡,细胞周期等方面变化情况差异。结果：1、miR-136表达水平与肿瘤的恶性程度成负相关。2、我们成功筛选和培养出对顺铂(cisplatinum)耐药的胶质瘤细胞株并命名为U251-CDDP。3、miR-136转染细胞后,与低表达组相比,miR-136高表达组在U251肿瘤细胞及U251-CDDP中均表现为明显的抑癌作用,如抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞迁移及诱导肿瘤细胞发生凋亡等作用。结论：1.miR-136具有抑癌基因的特点,其表达水平可以作为一项提示肿瘤恶性程度的重要指标2.miR-136具有能抑制U251细胞的增殖、促进细胞凋亡的能力。3 miR-136具有能够提高胶质瘤耐顺铂细胞株U251-CDDP对于化疗药物敏感性的能力。第二部分：miR-136可以通过下游靶基因E2F1发挥生物学作用目的：寻求miR-136可能的的靶点基因,证明这些靶基因与miR-136之间的相互作用关系,以及这种下游靶基因的基本生物学功能。方法：通过多个基因信息检索网站发现miR-136可能的作用靶基因E2F1,并据此设计了相应的引物,通过荧光素酶报告基因实验检测并验证E2F1与miR-136的关系。研究E2F1表达与肿瘤的恶性程度的相关性,通过增加E2F1或阻断E2F1表达的方法来研究E2F1表达变化前后细胞的生物学功能变化。具体包括利用MTS测定E2F1表达水平的改变对耐顺铂胶质瘤细胞株(U251-CDDP)的半数致死率(IC50)变化情况的影响,利用Trans-well实验、流式细胞实验和Western Blot等方法检测E2F1对于胶质瘤细胞的侵袭,凋亡和细胞周期的影响。结果：miR-136可以抑制其下游靶基因E2F1的表达。E2F1的表达和肿瘤的恶性程度成正相关。通过阻止E2F1的表达(siRNA-E2F1)可以使耐药肿瘤细胞的IC50下降,侵袭程度减少,抑制细增殖,促进凋亡,这些作用与miR-136的生物学功能类似,而转染E2F1后上述的这些生物学作用受到抑制。结论：miR-136与E2F1的关系密切且E2F1具有与miR-136相反的生物学功能,这些促癌生物学功能可以通过miR-136对E2F1的直接调控而被抑制。因此,我们的实验证明miR-136通过直接调节其下游靶基因E2F1来实现其生物学功能。第三部分：miR-136与抗肿瘤药物重楼皂苷D (polyphllin D)的关系目的：通过阐明新颖的单体化合物重楼皂苷D (polyphllin D, PD)对胶质瘤细胞的生物学作用及miR-136表达水平的影响,研究miR-136与PD的联系。并为实现miR-136的临床应用及更好的治疗脑胶质瘤提供新的思路和帮助。方法：我们选择重楼皂苷D作用于U87细胞后通过MTT实验检测细胞增殖情况,利用及流式仪检测了PD细胞凋亡的影响,利用western-blot实验检测了相关的凋亡蛋白,研究了可能的细胞通路。另外使用qRT-PCR技术测定U87细胞在PD作用后其miR-136的表达情况改变。结果：PD能够诱导胶质瘤细胞的凋亡,导致抗凋亡相关蛋白BCL-2及BAX表达下降,促凋亡蛋白caspase-3表达上升,进一步,通过qRT-PCR实验,我们发现PD干预处理后miR-136的表达相对升高,结论：PD具有诱导脑胶质瘤细胞凋亡的作用,且这种作用可能是通过miR-136的上调并作用相关下游靶基因获得的。因此,PD在实际临床运用中或许能起到类似于miR-136模拟物mimics的作用。