冠心病正逐渐成为现阶段危害人类健康的主要疾病之一。尽管各种治疗方式如药物溶栓、介入治疗和冠状动脉搭桥术在临床治疗过程中发挥了重要的作用,能有效改善血液循环,促进血运重建,挽救了大量冠心病患者;但对部分多支冠脉严重病变或者心肌梗死反复发作导致的难治性心肌缺血甚至缺血性心肌病患者效果仍然不佳,甚至对部分患者来说尽管缺血心肌得到了再灌注,但其带来的缺血再灌注损伤也不可忽视。随着基因工程技术的快速发展,不断有学者尝试采用基因治疗的方式为难治性心肌缺血及避免其血管再通后的缺血再灌注损伤提供新的治疗策略。目前非病毒基因载体转染方式的效率有待于进一步提高。一直以来,生物医学领域不断在探索新方法,试图提高目的基因转染效率以期达到与病毒载体相当的转染水平,如生物素-亲和素系统、抗原-抗体靶向结合、新型纳米微泡、磁性微泡等方式。目前这些方法都局限于突破细胞膜屏障,但真核细胞除细胞膜外,还存在核膜。核膜是外源性基因转染的重要屏障,所有物质必须经过核孔复合物才能进入细胞核。分子量<60 KD,直径9 nm以下的小分子物质可以被动扩散的方式通过核孔复合物,但是大分子物质如质粒DNA则必须经核定位信号(nuclear localization signal,NLS)肽介导的主动运输才能进入细胞核。带正电荷的NLS可首先与带负电荷的DNA通过静电吸附作用而结合,再与微泡组成新的亲核型载体,在转染时发挥重要作用。同时超声靶向辐照微泡破坏(ultrasound targeted microbubbles destruction,UTMD)作为一种非病毒载体基因转染方式其效果已经得到证实,其主要原理是微泡破坏时产生的空化效应使细胞膜通透性增加,促使外源性基因进入细胞发生转染。本研究在应用UTMD促进外源性DNA突破细胞膜的基础上,利用NLS肽作为入核向导增加外源性DNA进入细胞核以期能够提高转染效率。NLS主要有经典型和非经典型两类。经典核定位信号肽(classic nuclear localization signal,cNLS)发挥核转运功能除与DNA连接方式有关,还与多肽序列的顺序结构及氨基酸的种类密切相关。正确的序列结构才能被核输入受体结合。cNLS链接在货物蛋白的C端,当链接位置错误或者序列反向时,就不能被核输入受体识别,丧失了核输入功能。同样,为了证实cNLS的作用,有研究采用突变的方式使cNLS序列(126PKKKRKV132)中一个碱性氨基酸发生突变,如第128位的赖氨酸(K)突变为苏氨酸(T)时,该突变后的核定位信号肽(mutativenuclear localization signal,mNLS)就不能发挥相应的作用。为进一步验证cNLS在核转运时的作用,甚至有学者采用特殊物质如外源性凝集素来封闭核孔,阻碍带有cNLS的货物蛋白与核输入受体相结合,这样目的基因将不能入核发挥作用。在前期细胞实验基础上进行动物实验。既往在利用超声靶向辐照介导基因转染时主要采用经静脉注射超声靶向辐照微泡破坏(intravenous ultrasound targeted microbubble destruction,Ⅳ-UTMD)的方式,其相关研究已经取得一定的进展,但经静脉注射时微泡和目的基因需要通过静脉系统和肺循环后才能到达左心室,且部分又通过主动脉而分布全身,因此最后到达心肌组织的微泡和目的基因的量较少,难以最大程度的发挥生物学效应。而经冠状动脉注射的方式能通过侧支循环毛细血管网使目的基因较多聚集于靶组织周围,提高心肌组织目的基因的含量和浓度。因此本研究设想首先经冠脉注射使上述亲核型Ang1基因载体复合物大量聚集梗死周边区域,再通过超声辐照的空化效应使更多的目的基因进入心肌组织而发生转染,即采用经冠状动脉注射超声靶向微泡破坏(intracoronaryultrasound targeted microbubble destruction,IC-UTMD)的方式,并与常规Ⅳ-UTMD 相比,试图进一步提高心肌梗死治疗效果。同时,关于心肌注射的研究也取得相应的成果,但以往的心肌注射需要开胸,给实验动物造成严重损伤和感染,而超声引导下心肌注射可以克服上述不足,且被证实是安全可行的,因此本研究在冠状动脉注射的基础上,比较了心肌注射、冠状动脉注射和静脉注射几种治疗方式的疗效及安全性。基于以上背景,本研究有针对性地设计了新型亲核型载体系统以帮助Ang1基因转染顺利高效进行。(1)采用超声微泡作为基因载体,构成新的NLS-Ang1亲核型基因载体复合物,提高外源性目的基因进入细胞质和细胞核的效率,以提高基因转染效率;(2)为进一步验证cNLS在转染中的作用,采用mNLS和入核阻滞剂对cNLS介导的基因入核作用进行反面印证;(3)在心肌梗死模型上验证NLS增强Ang1基因入核转染的体内实验效果,并进一步采用经冠状动脉注射的方式增加靶区Ang1基因的含量,使更多的目的基因能够在心肌组织发生转染,促进血管新生,改善左室重构;(4)评估超声引导下经胸心肌注射、冠状动脉注射和静脉注射等多种方式联合超声靶向辐照的安全性及疗效。本研究相应分成四部分。第一部分:NLS肽在超声靶向辐照破坏微泡提高基因转染效率中的体外研究目的:利用超声靶向辐照微泡破坏(UTMD)技术联合核定位信号(NLS)肽促进hAng1-EGFP质粒入核,提高UTMD介导基因的转染效率。方法:用GV230质粒载体构建hAng1-EGFP质粒并进行鉴定,基因测序通过后大量提取质粒。合成NLS并进行质谱分析和HPLC检测。FITC荧光标记NLS,核酸染料Cy3标记hAng1-EGFP,调整NLS与hAng1-EGFP不同摩尔比,观测两者最佳结合比值。Zeta电位仪检测NLS-Ang1与微泡结合后的亲核型基因载体所带的电位。实验分 3 组:UTMD+phAng1-EGFP 组(A 组);UTMD+NLS+phAng1-EGFP组(B组)和阳离子脂质体Lipo3000+phAng1-EGFP组(C组)。以最佳超声辐照参数及NLS/phAng1-EGFP摩尔比转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。转染6 h后,用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别评价Cy3标记质粒的入胞率和入核率。转染48h后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8检测细胞存活率,RT-PCR和Western blotting分别检测mRNA和蛋白的相对表达量,并比较3组间的差异以评价NLS在UTMD介导基因转染中的增强效应。结果:①琼脂糖凝胶电泳实验和基因测序证实hAng1-EGFP质粒构建成功;NLS纯度分析高达98%以上。②转染6 h后,带绿色荧光的NLS和红色荧光的hAng1-EGFP均能在细胞同一部位显示且强度信号一致,提示两者相互结合;琼脂糖凝胶电泳示最佳NLS/hAng1-EGFP结合摩尔比为104:1。NLS-Ang1与微泡结合后带正电荷,表面电位为+11.7～57.51m。③转染6h后,ABC 3组质粒的入胞率分别为(63±12)%、(80土 10)%和(92土8)%;入核率分别为(17±3)%、(50±12)%和(35土8)%,差异有统计学意义(P<0.05),B组入胞率和入核率均值分别为A组的1.3倍和2.9倍,C组分别为A组的1.5倍和2.1倍。④转染48 h后,3组细胞活性均>80%,转染效率、mRNA和蛋白表达的相对量均依次增加,差异均有统计学意义(P<0.05),B组均值分别为A组1.6、2.3和2.4倍,但仍低于C组。结论:NLS与质粒和微泡构成的亲核型基因载体联合UTMD能提高hAngl-EGFP 质粒入核率,从而提高转染效率,NLS 的入核效应为 UTMD 介导转染提供新策略。第二部分:超声靶向辐照破坏微泡联合经典核定位信号肽cNLS促进基因转染的实验研究目的:利用超声靶向辐照微泡破坏(UTMD)技术联合经典核定位信号肽(cNLS)促进目的基因入核,提高转染效率。方法:用不同的方式将质粒DNA(pDNA)转入293T细胞。实验分4组:UTMD+pDNA(对照组),UTMD+pDNA+cNLS(经典型组),UTMD+pDNA+mNLS(突变型组)和UTMD+pDNA+cNLS+WGA(入核阻滞组)。NLS和pDNA分别用FITC和Cy3标记。转染6 h后,流式细胞仪检测Cy3阳性细胞百分比作为质粒入胞率,激光共聚焦显微镜观测细胞核中Cy3荧光强度占整个细胞荧光强度百分比作为质粒的入核率。转染48 h后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8检测细胞存活率,RT-PCR和Western blotting分别检测mRNA和蛋白的相对表达量,并比较上述指标在4组间的差异以评价cNLS在UTMD介导基因转染中的作用。结果:①转染6 h后,带绿色荧光标记的NLS在细胞内不同部位显示,经典型组大量入核,突变组细胞质和细胞核均可显示,入核阻滞组主要聚集在细胞质,未能入核;②转染6h后,4组质粒的入胞率分别为(61±11)%、(80±10)%、(55±9)%和(58±10)%;入核率分别为(20±4)%、(50±11)%、(18±3)%和(10±3)%,经典型组入核率和入胞率最高,入核阻滞组最低,差异有统计学意义(P<0.05)。③转染48 h后,4组细胞活性均>80%;转染效率、mRNA和蛋白相对表达量均在经典型组最高,入核阻滞组最低,差异均有统计学意义(均有P<0.05)。结论:UTMD联合cNLS能提高pEGFP入核率,从而提高目的基因转染效率,而mNLS和WGA均会影响转染效率。第三部分:经冠状动脉注射联合超声辐照提高NLS-Ang1基因载体转染效率促进犬急性心肌梗死后血管新生目的:在经导管冠状动脉栓塞法制备犬急性心肌梗死模型的基础上,经冠状动脉注射NLS-Ang1亲核型基因载体联合超声靶向辐照微泡破坏(IC-UTMD)促进血管新生治疗心肌梗死。方法:21只造模成功的杂种犬随机分成3组:对照组(n=7,经冠状动脉注射生理盐水),非亲核型组(n=7,经冠状动脉注射Ang1质粒和微泡),亲核型组(n=7,经冠状动脉注射NLS-Ang1亲核型基因载体)。梗死前、梗死后1小时和治疗1个月后分别行常规超声心动图和心肌灌注造影。治疗1个月后行心肌组织取材,TTC和伊文思蓝染色评价梗死范围百分比,Masson染色比较梗死心肌纤维化程度,免疫组化CD31定位新生毛细血管,组织冰切观察EGFP绿色荧光蛋白表达情况,RT-PCR和Western blotting检测hAng1质粒mRNA和蛋白相对表达量,比较各组梗死情况、血管新生效应和转染效率。并检测各组钙离子运作关键蛋白肌浆网Ca2+-ATP酶2a蛋白(SERCA2a)和受磷蛋白(PLB)表达量。透射电镜观察各组心肌超微结构变化。结果:①常规超声心动图参数比较,造模前、心梗后1小时和治疗1个月后LVEDD和LVESD在各组均呈现增大的趋势,亲核型载体组LVESD小于其他组,LVEF在亲核型组较非亲核型组改善,差异有统计学意义(P<0.05);②治疗1个月后心肌灌注造影亲核型载体组较非亲核型载体组造影强度增加,强度增长率提高(均有P<0.05);③TTC和伊文思蓝染色显示亲核载体组相对梗死范围减少;Masson染色示梗死后胶原纤维在对照组最多,亲核载体组明显减少;免疫组化CD31染色提示亲核型载体组新生血管较非亲核组增加(均有P<0.05);④转染效率的比较,冰冻切片显示亲核型载体组EGFP绿色荧光标记蛋白表达量较非亲核组增加;RT-PCR和Western blotting显示hAng1质粒mRNA和蛋白相对表达量在亲核型组较对照组和非亲核型组增多,差异有统计学意义(均有P<0.05)。⑤SERCA2a蛋白相对表达量从对照组、非亲核型组和亲核型组依次增高,PLB则依次降低,3组间差异均有统计学意义(均有P<0.05)。结论:亲核型基因载体联合经冠状动脉注射超声靶向辐照微泡破坏能提高质粒在犬心肌组织转染效率,从而促进血管新生,减轻心肌梗死范围和纤维化程度,改善左室重构。第四部分:超声引导下经胸穿刺心肌注射NLS-Angl基因联合UTMD治疗犬心肌梗死疗效及安全性评价目的:超声引导下经胸穿刺心肌注射血管生成素1(Ang1)基因联合超声靶向破坏微泡(UTMD)转染犬梗死心肌,评价其疗效及安全性。方法:52只杂种犬随机平分为4组,每组13只:①对照组(心梗造模但未经治疗);②心肌注射组(心梗造模后经胸超声引导下心肌注射+UTMD);③冠脉注射组(心梗造模后经冠状动脉注射+UTMD);④静脉注射组(心梗造模后经肘静脉动脉注射+UTMD)。治疗4周后比较各组心梗犬的存活率及常见并发症发生率;超声心动图测量左室大小和收缩功能;检测各组荧光质粒在心肌组织分布情况;Masson染色评价梗死纤维化程度;免疫荧光CD31和α-SMA染色评估新生毛细血管和微小动脉密度;RT-PCR和Western blotting检测Ang1基因mRNA和蛋白相对表达量。并进行血清肌钙蛋白(cTnI)和N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)浓度测定。比较上述指标以评价超声引导下经胸穿刺心肌注射Angl联合UTMD改善犬心肌梗死的安全性及疗效。结果:①四组间存活率及常见并发症比较,差异无统计学意义(P>0.05);②FITC绿色荧光在心肌组织分布情况显示,心肌注射组局部荧光最多,其次为冠脉注射组;②常规超声参数比较,心肌注射组较对照组LVESD减小、LVEF和FS增加,但低于冠脉注射组,差异有统计学意义(P<0.05);③Masson染色显示心肌注射组纤维化程度较对照组减轻,与冠脉注射组间差异无统计学意义(P>0.05);CD31和α-SMA荧光染色新生毛细血管和微小动脉在心肌注射组和冠脉注射组明显增多(P<0.05);④RT-PCR和Western blotting结果显示Angl的mRNA和蛋白相对表达量均在冠脉注射组最多,其次为心肌注射组,较对照组显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。⑤cTnI在心梗后24小时达峰,各治疗组高于对照组;NT-proBNP各治疗组从心梗7天后开始逐渐降低,至心梗后14天和1个月心肌注射组和冠脉注射组NT-proBNP浓度较对照组和静脉注射组明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。各时间点血清cTnI和NT-proBNP浓度在心肌注射组和冠脉注射组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:经胸超声引导下心肌注射联合UTMD是安全、有效的基因转染方式,其介导Angl转染可促进梗死心肌周边血管新生,减轻纤维化程度,与经冠脉注射相比后者转染效率更高、逆转左室重构,改善左室功能效果更显著。