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非生物逆境包括干旱,高盐和低温等是影响作物生长发育和产量的不利因素,因而研究植物对非生物逆境的适应机制一直是人们关注的焦点。已经有很多基因被证实参与了逆境响应通路,并且过表达后可以提高转基因植株的抗逆性能,其中就包括许多转录因子家族的成员。
(N-)AM,(A-)TAF,(C-)UC(NAC)是植物特有的转录因子,在植物的生长发育以及逆境响应中起到重要作用。拟南芥基因组中有105个ANACs,其中有些已经被证明参与了拟南芥中的逆境响应通路。最近,三个水稻中的NAC基因也被证明参与了逆境响应途径。为了更好的了解水稻中ONAC家族在逆境响应通路中的作用,我们首先从多个方面系统分析了水稻中的ONAC家族,然后根据分析结果从中挑选了三个受到非生物逆境诱导的ONACs进行初步的功能探索。
在我们鉴定的130个ONACs中,有52个位于染色体大片段复制区域,占到ONACs总数的40%,说明大片段的复制对ONAC家族成员的扩增起到了很重要的作用。根据NAC结构域的蛋白序列,可以将130个ONACs为I-Ⅸ9个group,其中只有少数成员的功能被研究过。根据NAC区域motif的组成,ONACs可以归为A-L12个group,每个group都包含一套独特的motif,可能反映了DNA结合特异性上的不同。我们还根据公共数据库里的芯片数据分析了ONACs的组织表达模式和在逆境下的诱导表达模式,最终鉴定了31个具有组织表达特异性的ONACs和28个受到逆境诱导的ONACs。这些分析结果对后续ONACs的功能研究有很好的提示作用。
根据ONAC家族分析的结果,我们选择了三个ONACs进行了进一步的功能分析,分别是ONAC045,OsNAC5/ONAC009和ONAC074。
ONAC045主要在根里表达,并且受到ABA,干旱,高盐和冷胁迫的诱导,分析其启动子序列发现多个MYB和MYC类转录因子的结合位点,这可能部分解释了ONAC045的诱导表达模式。酵母细胞中的反式激活实验证实ONAC045具有转录激活活性,且转录激活结构域位于160-359 aa之间。在洋葱表皮细胞中短暂表达GFP-ONAC045证明ONAC045是一个核定位蛋白。在水稻中过表达ONAC045可以提高转基因植株在苗期的耐旱和耐盐性能。两个逆境诱导的下游基因在转基因植株中的表达被上调。这些结果都说明ONAC045是一个参与了水稻逆境响应的转录因子,其在逆境耐受性作物遗传改良中具有潜在的应用价值。
数据分析的结果显示,亚家族group I的12个成员中有10个受到各种逆境的诱导,提示这个亚家族可能在水稻的逆境响应通路中起到重要作用。我们挑选了这个亚家族中的OsNAC5做了进一步的功能分析。OsNAC5的表达受到ABA,干旱以及高盐的诱导,其启动子序列中含有2个ABRE位点,5个MYB结合位点,多达12个MYC结合位点以及1个DRE位点,这提示OsNAC5可能同时参与了依赖于ABA的不依赖与ABA的逆境响应通路。我们将该基因在水稻中过量表达。目前已经得到了稳定的转基因株系,正在进行相关的抗逆分析。
ONAC074编码一个具有跨膜区域的NAC类转录因子。它的表达受到ABA,干旱,高盐和冷的诱导,其启动子区域包含2个ABRE位点,4个MYB结合位点和5个MYC结合位点。我们在水稻中过表达了全长的ONAC074和去掉蛋白C端编码区域(包括跨膜区域但并不影响转录激活区域)的74DeltaC,以考察ONAC074及其变异形式能否影响水稻的抗逆性能。目前,我们已经得到了过表达量比较高的株系,正在验证转基因植株是否能够提高水稻的抗逆性能。