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【研究背景】乳腺癌在世界女性恶性肿瘤中发病率最高,也是导致女性死亡的第二大癌症。随着对乳腺癌的不断深入研究,乳腺癌干细胞(BCSC)受到重视,BCSC是一群具有自我更新、多系分化潜能的细胞。它的自我更新能力使肿瘤干细胞大量增殖并分化,在乳腺癌的发生发展以及复发过程中发挥重要作用。BCSC表面标记包括CD44,CD24,Ep CAM,ALDH1等,CD44~+/CD24~-被认为是乳腺癌干细胞最典型的生物标志物。很多mi RNA参与调节肿瘤干细胞,包括促进或抑制肿瘤干细胞增殖的mi RNA,与肿瘤的发展和预后相关。在乳腺癌,胃癌等多种癌症中都有mi RNA的异常表达。相关文献报道它们的失调与乳腺癌的进展和转移有直接关系。mi RNA参与乳腺癌干细胞的生长,增殖,分化。我们课题组在前期实验发现mi R-205在乳腺癌发展过程中是一种肿瘤抑制因子,mi R-205可以抑制乳腺癌细胞的增殖,侵袭,上皮间质转化和干性。RUNX2属于RUNX家族成员之一,对于成骨细胞分化和软骨细胞成熟至关重要。我们先前的研究表明,RUNX2在乳腺癌细胞中高表达,RUNX2促进乳腺肿瘤的发生,发展和侵袭。随着表观遗传学和相关调控机制的出现,mi RNA在基因表达的转录后水平上被认为是最有效的调控因子之一。其中,在胰腺癌,骨肉瘤中micro RNA-205通过靶向RUNX2充当肿瘤抑制因子。但是在乳腺癌中micro RNA-205与RUNX2之间的关系尚未报道。在本课题中,体外实验检测同时上调micro RNA-205和RUNX2的表达对乳腺癌细胞增殖,侵袭,迁移,干性的影响,体内裸鼠成瘤实验观察micro RNA-205和RUNX2对裸鼠成瘤的影响。通过探讨micro RNA-205和RUNX2之间的关系,为乳腺癌临床治疗提供新的策略。【研究目的】在前期课题组研究的基础上,进一步验证micro RNA-205与RUNX2的调控关系,micro RNA-205是否通过靶向RUNX2抑制乳腺癌细胞的干性和恶性生物学行为。【研究方法】1. 在人乳腺癌MCF-7细胞中,用慢病毒感染的方式建立micro-NC,micro RNA-205-5p,LV-RUNX2以及共转Micro RNA-205-5p与RUNX2的稳定细胞株。2. 在荧光显微镜下观察所有转染的细胞株的GFP荧光,并用q RT-PCR检测转染效率。3. Western blot和RT-PCR检测RUNX2的表达。Western blot检测乳腺癌干细胞标志物CD44和CD24表达,流式细胞术筛选CD44~+/CD24~-干细胞的比例,微球体实验观察每组细胞微球体形成能力。4.体外实验:通过MTT,平板克隆,Transwell,软琼脂集落实验分别检测细胞增殖,侵袭,迁移,非锚定生长能力。5.体内实验:通过裸鼠成瘤实验观察其成瘤能力。【研究结果】1.成功构建了过表达micro RNA-205-5p和RUNX2的稳定细胞株。2.Western blot和RT-PCR实验结果显示增加micro RNA-205-5p表达会导致RUNX2蛋白和m RNA的表达水平下降,同时过表达micro RNA-205-5p与RUNX2会逆转其结果。3. micro RNA-205-5p和RUNX2对乳腺癌干细胞的影响:Western blot实验发现外源性增加micro RNA-205的表达后CD44的表达下降,CD24表达增加,而同时转染过表达RUNX2会干扰micro RNA-205-5p的表达导致干细胞标志物表达水平的升高。流式细胞术和微球体实验均发现microRNA-205-5p可以通过调控RUNX2来抑制乳腺癌细胞的干性。4. MTT,Transwell,软琼脂集落实验结果显示在MCF-7细胞中micro RNA-205-5p可以通过靶向RUNX2抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。5. 与单独过表达RUNX2相比,同时过表达micro RNA-205-5p和RUNX2,肿瘤生长的速度更慢,肿瘤体积更小。【结论】在乳腺癌MCF-7细胞中,micro RNA-205-5p可以调控RUNX2的表达,micro RNA-205-5p通过靶向RUNX2抑制乳腺癌细胞的恶性行为学和干性。