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目的:获取一种全新的I型核糖体失活蛋白:南瓜蛋白2(cucurmosin2,CUS2),探讨CUS2体外对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。研究CUS2诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的有效性及可能的作用机制,为南瓜蛋白2可能的抗肝癌临床应用提供实验依据和理论基础。方法:1.采用Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱分离纯化CUS2;SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定CUS2并计算其分子量;BCA法测定CUS2浓度。2.SRB法检测CUS2体外对人肝癌HepG2细胞和人胚肝细胞系L02细胞增殖的影响,评价其对人肝癌细胞作用的选择性。3.经CUS2作用后HepG2细胞Hoechst 33258荧光染色分析。4.电子显微镜观察经CUS2作用后HepG2细胞的超微结构变化。5.PI流式细胞法检测CUS2对HepG2细胞增殖周期的影响。6.ELISA法检测经CUS2作用后HepG2细胞Caspase 3、Caspase 9酶的活性。7.Western blot法检测CUS2对HepG2细胞GOLPH3、mTOR、Akt、Raf、Ras、Caspase3蛋白表达水平的影响。结果:1.经Sp-Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱柱层析技术,280nm处核酸蛋白检测仪检测得到两个洗脱峰,获得2种南瓜蛋白CUS1和CUS2,经SDS-PAGE电泳鉴定均为单一条带,CUS1和CUS2均达到了电泳纯,分子量分别约为28.2 k Da和29.0 k Da。2.SRB法检测结果显示,CUS2对体外培养的HepG2细胞具有显著的增殖抑制作用,呈现明显的药物浓度依赖性和时间依赖性。不同浓度(0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00及40.00μg/ml)的CUS2作用于HepG2细胞72 h的增殖抑制率分别为9.50%、15.74%、27.71%、43.15%、55.70%、69.10%、82.80%,IC50为6.74±0.25μg/ml。CUS2作用24、48、72、96及120 h的IC50分别为(38.23±1.83)、(17.97±1.93)、(7.28±0.26)、(6.27±0.28)和(5.50±0.37)μg/ml。CUS2对人胚肝细胞系L02细胞的IC50约为34.29±3.09μg/ml,初步表明CUS2对人肝癌HepG2细胞有强大的杀伤作用,且杀伤作用远比对正常肝组织细胞的强。3.人肝癌HepG2细胞经CUS2作用后荧光显微镜下可见典型的凋亡细胞形态特征:细胞膜完整,体积变小,核染色质凝集,核固缩。电子显微镜下表现为核内染色质浓集,部分核膜消失,或者出现核碎裂,有的凋亡细胞已破碎为凋亡小体。流式细胞法结果显示,不同浓度(0、2.50、10.00及40.00μg/ml)CUS2作用72 h后细胞凋亡率分别为(2.37±0.19)%、(17.22±0.29)%、(36.78±1.81)%及(66.35±2.35)%。与对照组相比,CUS2诱导HepG2细胞主要阻滞于S期和G2期,从而诱导细胞凋亡,随着药物浓度的升高,细胞的凋亡率逐渐增加,呈浓度依赖性。4.不同浓度(0、2.50、10.00及40.00μg/ml)CUS2作用于HepG2细胞72h后,ELISA方法检测结果显示Caspase 3与Caspase 9均被不同程度的活化,呈明显的药物浓度依赖性;蛋白质印迹法检测结果显示,HepG2细胞GOLPH3、mTOR、Akt蛋白表达逐渐减弱;随着药物浓度的升高,Raf、Ras蛋白表达逐渐减弱,caspase 3的活性片段被不同程度的激活,呈明显的药物浓度依赖性。结论:1.CUS2是一种与CUS1有别的全新的I型核糖体失活蛋白,其分子量约为29.0 k Da。2.CUS2能有效诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。3.CUS2诱导HepG2细胞凋亡的机制可能与其下调GOLPH3、mTOR、Akt、Raf、Ras蛋白表达水平,然后激活caspase9,并最终激活下游caspase3有关。