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寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)是一种碱基数目通常少于五十个的脱氧核苷酸序列,存在于自然界某些低等生物基因组的DNA中,易于与它们的互补链相互对接。MT01是依据人线粒体DNA人工设计合成的含有27个碱基的特定序列ODN,通过胞吞作用进入细胞,可与Toll样受体9(Toll like receptor 9,TLR9)和Toll样受体7(Toll like receptor 7,TLR7)结合,增强人和大鼠成骨细胞内成骨标志性基因如Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)等在mRNA水平的表达,从而促进成骨细胞的分化,但MT01易于被核酸酶降解且其表面的负电荷与细胞膜表面的负电荷存在静电排斥影响细胞摄取率,故有研究使用对MT01进行硫代修饰形成的MT01-S,虽然可以在一定程度上阻断细胞内的核酸酶对MT01的降解,但可能对机体造成一系列不良反应,因此本实验欲研究新型载体PEN可否用于装载游离的MT01使其更好地发挥效用。目的:本实验通过构建PEN/MT01复合物,检测其对BMSCs细胞增殖及细胞内成骨相关基因ALP、Runx2及COL-Ⅰ表达的影响,探讨PEN能否成为MT01的有效载体协同影响大鼠BMSCs的细胞增殖及分化过程。方法:首先,通过静电装载方式制备出PEN与MT01不同质量比例的7种混合物,即PEN与 MT01 的质量比例分别为:0.5:1、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1 和 10:1,形成7种不同的PEN/MT01复合物后对大鼠BMSCs进行细胞内的转染,检测BMSCs的细胞增值率,通过与单纯的PEN载体组以及空白对照组进行对比,筛选出需要进一步研究的PEN/MT01复合物的最佳质量比例。然后,分别设置游离的MT01组、MT01-S组和空白对照组,与筛选出的最佳质量比例的PEN/MT01复合物组进行对照,检测BMSCs细胞内ALP、Runx2及COL-Ⅰ的表达水平,评估该复合物是否对大鼠BMSCs的分化有影响。实验一:MTT比色法检测PEN/MT01复合物作用下BMSCs的细胞增殖率,目的是筛选出PEN与MT01的最佳装载质量比例;实验二:通过碱性磷酸酶试剂盒检测筛选出的PEN/MT01复合物对BMSCs细胞内成骨分化相关蛋白碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响;实验三:通过Real time-PCR法检测筛选出的PEN/MT01复合物对BMSCs细胞内成骨标志性基因Runx2和Collagen-Ⅰ在基因表达水平的影响;实验四:通过碱性磷酸酶染色,观察筛选出的PEN/MT01复合物对BMSCs体外成骨分化的影响;结果:BMSCs细胞增殖率检测结果表明,转染后第1天,PEN与MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物对BMSCs的细胞存活率影响最小,并且随时间的延长至转染后的第2天、第3天,PEN与MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物组BMSCs的细胞增值率均最高(p<0.01),提示该比例复合物对BMSCs的细胞增殖有最佳促进作用,故筛选得出的PEN与MT01静电装载的最佳质量比例为2:1。BMSCs细胞内碱性磷酸酶活性检测实验中发现,在游离的MT01组、MT01-S组、2:1的PEN/MT01复合物组、6:1的PEN/MT01复合物组以及空白对照组中,在所检测的三个时间点即第1天、第3天和第5天,2:1的PEN/MT01复合物组BMSCs细胞内碱性磷酸酶活性的表达均最高(p<0.01),优于MT01-S组及其他各组。BMSCs细胞内成骨标志性基因的Realtime-PCR检测实验表明,在游离的MT01组、MT01-S组、2:1的PEN/MT01复合物组以及空白对照组中,与空白对照组相比,其他三个组BMSCs细胞内成骨标志性基因Runx2和Collagen-Ⅰ的表达均有升高。其中,从成骨相关基因Runx2的检测结果来看,在第3天时,MT01-S组Runx2的表达高于其他三组,随时间的延长到转染后第5天,2:1的PEN/MT01复合物组Runx2表达显著升高(p<0.01),明显高于其他组,基因表达显著的优势持续到转染后的第7天;从成骨相关基因Collagen-Ⅰ的检测结果来看,在第3天、第5天、第7天三个时间点,都是PEN和MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物组基因表达水平最高(p<0.01),均优于其他组。碱性磷酸酶染色发现,PEN和MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物组碱性磷酸酶染色的颜色最深,其次分别是MT01-S组、游离的MT01组和空白对照组。结论:PEN可以用来做为一种载体去搭载MT01,能有效提高游离的MT01被细胞内吞的效率,PEN与MT01以不同质量比例装载形成的PEN/MT01复合物均可对骨髓间充质干细胞的细胞增殖产生影响,当PEN与MT01质量装载比例达到6:1时,细胞毒性开始逐渐显现,随着PEN/MT01复合物内PEN所占质量比例的增大,PEN/MT01复合物对BMSCs的细胞毒性也逐渐增大,当PEN与MT01的质量装载比例为2:1时大鼠BMSCs的细胞存活率最高,并且随时间的延长该比例的复合物对BMSCs的细胞增殖过程有最佳促进作用,故选取PEN与MT01质量比例为2:1的PEN/MT01复合物,研究其能否对BMSCs的成骨分化产生影响;本实验发现筛选出的2:1的PEN/MT01复合物可以增强BMSCs细胞内碱性磷酸酶在蛋白水平与骨改建相关因子Runx2和Collagen-Ⅰ在基因水平的表达,并且其增强效果优于MT01-S组、游离的MT01组以及空白对照组。