研究背景血栓栓塞性疾病是一种非常常见的心脑血管疾病。海洋来源溶栓物质逐渐成为近年来研究的热点。本课题组前期通过分子生物学技术从方格星虫消化道内克隆出一种新型纤溶蛋白酶的全长基因,经密码子优化后命名为PL,并成功构建了工程菌GS115-pPIC9-PL及与Cytoglobin融合的工程菌GS115-pPIC9-CYGB-PL。研究目的本课题旨在建立一套重组方格星虫纤溶酶PL、CYGB-PL的纯化工艺,研究PL、CYGB-PL的酶学性质及体内外溶栓活力,为重组方格星虫纤溶酶的产业化制备与应用提供了理论依据。研究方法（1）利用柱层析、切向流超滤和盐析结合的方法,分离纯化PL与CYGB-PL;通过纤维平板法检测不同温度、抑制剂、pH和金属离子对酶活力的影响,进而研究酶学性质;（2）采用基因工程的方法,制备CYGB-PL-His,以尝试简化纯化步骤;（3）通过体外PL与CYGB-PL对纤维蛋白原的降解方式和溶解血块速率,检测其体外溶栓效果;（4）小鼠尾部的血栓模型,验证体内溶栓效果。研究结果（1）目的蛋白PL的纯化,经超滤浓缩、DEAE梯度洗脱和Heparin梯度洗脱,从1 L发酵液中纯化得到5.04 mg酶活力为1324.98 U/mg的PL,回收率为18.00%;体外酶学实验研究表明:PL具有良好的热稳定性,酶活力在pH 5.0⁹.0时较稳定;Cu²⁺和PMSF对纤溶酶活性的表现较为强烈的抑制作用;（2）对比结果表明CYGB-PL发酵表达量比PL增加了47.65%;CYGB-PL的纯化,经30%⁸0%硫酸铵分步盐析、G-25脱盐和DEAE梯度洗脱,从1 L发酵液中纯化得到10.19 mg酶活力为658.70 U/mg CYGB-PL,回收率为14.65%;体外酶学实验研究表明:CYGB-PL酶学性质与PL相似;（3）成功构建工程菌GS115-pPIC9-CYGB-PL-His,但酶活性小于CYGB-PL;（4）体内外实验研究表明:PL与CYGB-PL不仅能够直接降解纤维蛋白而且可将纤溶酶原激活为纤溶酶;水解纤维蛋白原的顺序:Aα链>Bβ链>γ链;在体外能够溶解血块;在体内对小鼠尾部血栓有一定的疗效。结论本论文实验结果证明,CYGB-PL的表达量比PL高,通过上述工艺路线纯化的PL与CYGB-PL均具有良好pH和热稳定性,体内外实验均证明都具有溶栓效果,为方格星虫纤溶酶的应用提供了理论基础。