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水通道蛋白是可以促进水分跨越生物膜运输的通道，也是调控生物体内水分运输的重要途径。研究水通道蛋白的活性调控机制能更好地了解其功能。近年来研究人员发现，水通道蛋白的活性不仅受到门控机制的调节，同时还受到亚细胞循环的严格调控。目前已有研究者开始关注模式植物拟南芥活细胞内水通道蛋白的亚细胞循环，但是对其掩藏于宏观研究之下的蛋白动力学特征和异质微环境却知之甚少。本论文在单分子水平上对拟南芥细胞膜水通道蛋白PIP2;1(plasmamembraneintrinsicprotein，PIP)的动态特征和内吞途径进行了研究。
在拟南芥中表达了GFP标记的PIP2;1融合蛋白，以确保每个PIP2;1分子仅被一个荧光蛋白标记。通过荧光定位检测显示，GFP-PIP2;1融合蛋白可以准确的定位到拟南芥幼苗根部的细胞质膜上，特别是根部表皮细胞质膜上，由此表明GFP标记并未影响PIP2;1的质膜定位。另外，爪蟾卵母细胞的渗透性测定数据显示，转有GFP-PIP2;1RNA的爪蟾卵母细胞对水的通透能力非常高，证明GFP-PIP2;1融合蛋白仍然具有水分运输通道的功能。
通过应用隐失波显微术(evanescentwavemicroscopy,EWM)，亦称全内反射显微术(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,TIRFM)观察拟南芥幼苗根表皮细胞上的GFP-PIP2;1分子，并在完整植株中开展了PIP2;1蛋白寡聚状态的分析。首先，将纯化的GFP蛋白固定于载玻片，分析其荧光强度和荧光漂白特征，以确定单个GFP分子的荧光特征作为基线。然后，在相同激光强度及观察条件下，观察活细胞质膜上的GFP-PIP2;1分子。结合荧光强度统计和漂白步数分析，研究结果显示，PIP2;1可以在细胞质膜上以四聚体状态存在，但是并未完全排除单体、二聚体和三聚体的存在。
EWM观察表明，GFP-PIP2;1分子在细胞质膜上呈现侧向位移的动态，对活细胞质膜上GFP-PIP2;1的动力学特征进行分析，以及单颗粒示踪(singleparticletracking，SPT)分析，结果发现PIP2;1在细胞质膜上存在多种运动模式，而且扩散系数分布范围较广。更为重要的是，该蛋白可以通过侧向运动进入/离开特定的质膜微区，从而证实PIP2;1在细胞质膜上的运动和分布具有非均一性的特点。
为了进一步分析PIP2;1在质膜上的动态分布与质膜微区的关系，我们应用固醇抽提试剂(methyl-β-cyclodextrin，MβCD)处理拟南芥幼苗，通过EWM的观察发现，MβCD导致GFP-PIP2;1在质膜上的分布发生显著变化，并由分散分布变为聚集成小颗粒，由此说明GFP-PIP2;1的分布和固醇密切相关。考虑到膜筏是富含固醇的质膜微区，为进一步确定PIP2;1与膜筏的关系，在拟南芥中共转化膜筏标识蛋白mCherry-Flot1和GFP-PIP2;1，经共定位分析显示，质膜上一部分PIP2;1分子和Flot存在共定位，说明部分GFP-PIP2;1定位在膜筏上。
细胞质膜和胞质内定位的动态循环是PIP2;1活性调控的一种重要方式。在高渗胁迫条件下，PIP2;1在质膜上的连续分布消失，细胞内出现大量含有GFP-PIP2;1荧光的结构，说明内吞增加是PIP2;1分子应对高渗胁迫的一种响应策略。
为深入研究在不同条件下PIP2;1的内吞途径，分别对clathrin-依赖和raft-相关两条内吞途径的标识性蛋白(mCherry-CLC、mCherry-Flot1)与PIP2;1的相关性进行分析。通过单分子共定位分析和荧光互相关光谱(fluorescencecrosscorrelationspectroscopy,FCCS)结果显示，在正常条件下，mCherry-CLC与PIP2;1的相关性较高，高渗条件下mCherry-Flot1与PIP2;1的相关性显著增强。进一步应用干扰内吞途径的试剂进行药理学处理，通过对PIP2;1分子的动力学特征分析和荧光相关光谱(fluorescencecorrelationspectroscopy,FCS)测定PIP2;1密度的结果表明，正常条件下干扰clathrin-依赖途径显著抑制PIP2;1的内吞，而干扰raft-相关途径对PIP2;1的内吞影响不大;在高渗条件下，干扰两条途径均显著抑制了PIP2;1的内吞。
综上所述，借助于高时空分辨率的成像技术和光谱技术，在单分子水平上对水通道蛋白PIP2;1的分子动态进行了分析，从而促进了PIP2;1的调控机制的研究。通过研究发现:(1)细胞质膜上的PIP2;1的运动呈现异质性;(2)细胞质膜上的PIP2;1在膜筏区和非筏区间为动态分布;(3)高渗条件下，raft-相关内吞途径被激活，与clathrin-依赖途径协同介导PIP2;1内吞。本研究首次在植物活细胞中，实现了在单分子水平上分析单个蛋白的分布、聚合状态、内吞过程及其调控之间的联系，从而进一步揭示了不同内吞途径参与多元调控PIP2;1蛋白活性的新机制。