紫薇花器官发育相关基因的克隆及表达特性分析

来源 :中南林业科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ourl123
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紫薇(Lagerstroemia indica L.)为千屈菜科、紫薇属木本植物。其树姿优美,花繁色艳,花期长,抗污染等特点,不仅适合栽种于庭院,公园,道路两旁,也可用于室内盆景和切花观赏,是我国重要的夏季观赏树种,深受人们的青睐。提高其观赏价值是紫薇育种工作方面首要关注的问题,尤其是对紫薇开花方面的研究,可在一定程度上给紫薇育种提供理论依据,促进紫薇育种研究创新与应用。因此,本论文从紫薇花器官发育相关基因的克隆、表达模式分析、原核表达、亚细胞定位以及转基因拟南芥等方面入手,对紫薇花器官发育相关基因进行分离和初步的功能验证,为深入研究紫薇开花的分子机理提供一定的科学依据。本论文的主要研究内容如下:(1)在紫薇转录组数据的基础上,利用RT-PCR技术,从紫薇花芽中分离出4个参与紫薇花器官发育调控的MADS-box基因,分别命名为LiFUL1、LiAP3、LiAG、LiAGL11。多序列比对和系统进化分析发现,获得的序列均具有保守性较高的MIKC结构域,LiFUL1属于AP1/FUL亚家族的euFUL进化支,C末端具有euFUL motif;LiAP3属于B类基因,C末端有保守的euAP3 motif;LiAG属于C类基因,其C末端具有保守的AG motif Ⅰ和AG motifⅡ;LiAGL11属于D类基因。聚类分析表明,从紫薇中分离得到的这4个基因均与石榴(Punica granatum)聚为一支,说明这4个调控紫薇花器官发育的MADS-box基因均与石榴的亲缘关系最近。(2)利用实时荧光定量PCR技术分析了这4个基因的表达模式,结果表明,LiFUL1不仅在花器官当中表达,也在茎、叶当中表达,其他4个基因均有组织表达特异性,仅在花芽花器官中表达。LiAP3、LiAG、LiAGL11在花器官发育直至开花阶段基本呈上升趋势。4个基因在两个不同紫薇品种‘红叶’和‘湘韵’中的表达量均有一定差异。(3)将分离得到的LiFUL1、LiAP3、LiAG基因与携带绿色荧光蛋白(GFP)的pCAMBIA1300载体构建重组质粒,采用农杆菌介导法瞬时转化烟草,结果表明,目的基因均定位于细胞核中。(4)利用原核表达系统,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了 LiFUL1-pCold-TF重组蛋白,超声处理后的液体中有大量的蛋白富集,说明诱导表达的目的蛋白以可溶性蛋白的形式存在,使用不同浓度的IPTG诱导剂对蛋白的表达有一定影响,得到的蛋白条带与预测的蛋白质分子量相一致。根据咪唑竞争性的与His标签蛋白结合的原理,将目的蛋白进行了纯化。这在蛋白质水平上为研究基因的功能奠定基础。(5)构建了 LiFUL1、LiAP3基因与植物表达载体PBI121的重组质粒,转化农杆菌,采用花序浸染法转化拟南芥,收集T0代种子,在抗性筛选培养基上筛选出颜色翠绿正常生长的幼苗,而不具抗性的幼苗则褪绿泛白。本试验为深入研究紫薇花器官发育相关的分子机理提供基础数据。
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