前言:内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，即能循环、增殖并分化为成熟血管内皮细胞。自从1997年Asahara等首次从成人外周血中分离出EPCs，并证实EPCs在生后的生理性和病理性血管新生中发挥重要作用以来。EPCs介导的缺血组织血管再生(即治疗性血管新生)的研究已取得了较大的进展。　　 正常情况下，骨髓中EPCs处于休眠状态，细胞因子可以促进EPCs动员、迁移和分化并参与新血管形成。EPCS的多向分化潜能是其最重要的生物学特征，EPCs具体向哪个方向分化及其调控机制是目前研究的热点。以往认为，内皮细胞和平滑肌细胞来源于不同的前体细胞，但最近Yamashita和Lino等人的研究发现，内皮细胞和平滑肌细胞可以来自同一前体细胞。而且有人在体内外的血管形成研究中发现，成熟的内皮细胞可以转分化为血管平滑肌细胞。因此，这些均可为研究EPCs的平滑肌分化潜能奠定一定的理论基础。　　 EPCs的分化受多种因素的影响，如缺氧、生长因子等，然后通过复杂的信号通路调节细胞内多种基因的表达，最终引起EPCs的不同方向分化。血管内皮细胞生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)主要通过对内皮细胞的直接丝裂原作用促进新生血管的形成。PDGF-BB是目前研究其在血管形成和稳定方面比较热点的一种生长因子，Betsholtz将PDGF-B和PDGFR-β基因敲出后发现：新形成的血管缺乏周细胞/平滑肌细胞募集，这也说明PDGF-BB是血管成熟的重要因子。　　 目前人们就治疗性血管新生进行了广泛的研究，但是许多研究还只是注重新生血管形成的多少而忽略了新形成血管的成熟性和稳定性。一个成熟、功能血管网的形成需要内皮细胞和平滑肌细胞的相互作用，因为内皮细胞只能启动血管形成过程，但不能完善新形成的血管，如果要想使新生血管成熟，则必须要有平滑肌/周细胞的参与。因此，如果能分离出既能分化为内皮细胞又能分化为平滑肌细胞潜能的干/祖细胞，同时这种干/祖细胞源性的内皮细胞和平滑肌细胞又具有明显的增殖、迁移能力，这将为功能血管网的形成奠定雄厚的基础。　　 内皮祖细胞可以分化为内皮细胞并参与在治疗性血管生成中，这一现象早已被许多实验所证实。通常生长因子与细胞表面的受体结合后，可以激活其下游分子而发挥促细胞分化、增殖等作用。磷脂酶C-γ(PLC-γ)是生长因子信号通路的一个重要信号中介，可被生长因子酪氨酸受体所激活，细胞外生长因子调节细胞生长和分化主要通过其受体的酪氨酸激酶被活化而发挥作用的。通常人们认为PLC-γ是一个与细胞增殖和分化有重要关系的分子。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞发挥功能的重要信号转导通路。真核细胞中，已确定出ERK(p42/p44MAPK)，JNK/SAPK，p38MAPK及ERK5四条MAPK信号转导通路。其中JNK和p38MAPK两条通路主要与细胞的应激和凋亡有关，而在细胞信号转导网络中处于枢纽地位的ERK通路主要与细胞的增殖和分化密切相关。　　 基于EPCs的多向分化潜能以及bFGF和PDGF-BB在体内稳定新形成血管的作用，本研究假设在bFGF和PDGF-BB分别诱导下，大鼠骨髓EPCs能向血管内皮样细胞和平滑肌样细胞分化并参与成熟功能血管网的形成；同时通过检测这二种细胞的增殖、迁移和形成血管的能力明确其能否成为新血管形成的种子细胞。此外，探究bFGF和PDGF-BB介导内皮祖细胞分化、增殖的相关信号分子的表达，为阐明内皮祖细胞的多向分化机制奠定坚实的理论基础。　　 方法:　　 1、大鼠内皮祖细胞分离、培养及鉴定采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs；收集培养5d的EPCs，经免疫荧光染色，AC133和vWF双染阳性细胞为正在分化的EPCs。　　 2、EPCs的诱导培养及形态观察EPCs被培养5天后，进行分组，对照组仅给20％胎牛血清的DMEM培养基；bFGF组在20％胎牛血清的DMEM培养基中添加bFGF(30ng/ml)；PDGF-BB组在20％胎牛血清的DMEM培养基中添加PDGF-BB(40ng/ml)。共培养14天，培养期间每2-3天换液并补充相应生长因子。每天观察细胞形态变化并采集图像。　　 3、免疫荧光检测EPCs分化标记物EPCs在置有玻片的24孔板内被诱导到第4天和第8天时，换无血清培养基孵育24h后，取出玻片，经4％多聚甲醛固定，5％BSA.封闭后加入一抗，4℃过夜，加入FITC、PE和TRITC分别标记的相应二抗，37℃孵育，封片，荧光显微镜观察、采集图像并进行荧光强度分析。　　 4、Westerll Blotting检测EPCs分化相关蛋白表达取EPCs被诱导到第4天和第8天时的细胞进行检测：各组细胞进行蛋白质提取后，-70℃保存备用。配制浓缩胶及分离胶，上样后电泳2.5h，PVDF转膜1-2.5h，5％脱脂奶粉封闭1.5h，加一抗(1:200)，4℃过夜，二抗(1:1000)室温孵育1h，DAB染色，测定灰度值。　　 5、透射电子显微镜检测分化后EPCs的超微结构被诱导至14天的各组细胞经消化，离心(1000rmp，10min)，收集细胞后用2.5％戊二醛在4℃固定60 min，漂洗后再用1％OSO4固定90min，置梯度丙酮中逐级脱水、媒浸、包埋、聚合、切片，用醋酸铀和枸橼酸铅双重电子染色，透射电子显微镜观察细胞内超微结构变化。　　 6、流式细胞仪分析分化细胞百分率用0.125％胰蛋白酶消化各组细胞，终止消化，将细胞悬液离心(1000rpm.5min)，弃上清；用0.5％BSA-PBS漂洗再离心，收集入1.5ml EP管；向bFGF组细胞内加入vWF抗体，向PDGF-BB组细胞内加入α-SMA抗体，对照组内同时加入vWF和α-SMA抗体，37℃，40min；0.5％BSA-PBS漂洗，再向各组加入相应FTTC标记及PE标记二抗，37℃，20min，并设同型对照；重悬细胞，流式细胞仪检测。　　 7、内皮样和平滑肌样细胞活力检测　　 (1)MTT法检测被诱导细胞增殖活性消化收集各组细胞；以5×103/孔的细胞数接种于96孔板中，每孔体积200μl；放入37℃、5％CO2的孵育箱内培养2h；待细胞基本融合，加入3％血清DMEM作用24h；分组：①时间依赖组：内皮样细胞中加入bFGF(10ng/ml)、平滑肌样细胞中加入PDGF-BB(15ng/ml)并设立相应对照组，分别作用0h、6h、12h、24h，48h；②浓度依赖组：内皮样细胞中按0、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml和16ng/ml浓度梯度加入bFGF；平滑肌样细胞中按0、3ng/ml、6ng/ml、9ng/ml和18ng/ml加入PDGF-BB，作用24小时，每个实验组设5个平行孔；检测时，每孔加入20μlMTT(5mg/ml)孵育4h，吸除孔内液体，每孔加入150μlDMSO，微量振荡器震荡10min，置酶标仪测定OD490值。　　 (2)内皮样和平滑肌样细胞迁移的检测消化各组细胞，用含10％FBS的DMEM培养液制成单细胞悬液；以5×104/小室的细胞数加入Transwell小室的上室，体积200μl，将600μl无血清DMEM加入Transwell小室的下室，并按(1)中的分组加入bFGF和PDGF-BB；每组设3个复孔。检测时，吸除上室培养液，PBS冲洗，用棉签擦拭膜上表面未迁移的细胞；甲醇固定膜，吉姆萨染色；将膜切下，用中性树胶封固于载玻片上；光学显微镜下随机选取5个视野计数迁移的细胞数。　　 (3)内皮样和平滑肌样细胞形成管腔的检测将Matrigel胶置于4℃冰箱过夜，使之冻融；预冷的24孔板加入Matrigel150μL/孔，37℃孵育1h备用；消化各组细胞，用含10％FBS的DMEM培养液制成单细胞悬液；以5～6×105/ml的细胞数接种细胞于涂有Matrigel的24孔板内，培养24-48h。共分四组：①只接种内皮样细胞；②只接种平滑肌样细胞：③在内皮样(未标记的)形成的管腔中加入平滑肌样细胞(未标记的)共同接种；④将预先用PKH26标记(红色)的内皮样细胞和PKH67标记的平滑肌样细胞(绿色)以3:1的比例(4.5×105/ml：1.5×105/ml)混合接种。在100倍倒置荧光相差显微镜下观察并采集图像。　　 8、Real-time PCR检测bFGF和PDGF-BB作用EPCs后PDGFRβmRNA表达将培养5天的EPCs，静止12h，再分别用bFGF和PDGF-BB作用30min、60min、90min和180min，进行RNA抽提并测定OD260/OD280，反转录后按下列条件在荧光定量PCR仪上扩增：95℃，90sec，1个循环；95℃，5sec、58℃，30sec和72℃，4min，45个循环。最后计算mRNA的相对表达量。每个样本设3个复孔。　　 9、Western Blot检测EPCs分化相关的PLC-γ和p-ERK的表达将培养5天的EPCs，静止12小时，再分别用bFGF和PDGF-BB作用30min、60min和90min，检测PLC-γ和p-ERK的表达。细胞蛋白质的提取、浓度测定、电泳及转印如上文十、ELISA检测bFGF和PDGF-BB作用EPCs后VEGF的分泌将培养5天的EPCs，静止12小时，再分别用bFGF(10ng/ml)和PDGF-BB(15ng/ml)作用4h、8h和12h后收集各组细胞培养上清并离心去沉淀(30分钟，2500转/分钟)，收集上清保存于-20℃。按试剂盒说明书按步骤进行，根据标准曲线的直线回归方程计算出样品浓度。　　 结果:　　 1、内皮祖细胞培养、鉴定原代培养24h后，细胞大部分呈小圆形；差速贴壁筛选后，培养一天可见少量细胞贴壁；第2天即可观察到多且大小相对均一的圆形贴壁细胞，陆续可见从细胞一侧伸出芽状突起并逐渐伸展成梭形或纺锤形，第5天时呈“铺路石”样排列。在第5天采用免疫荧光进行CD133+vWF双标染色，细胞同时表达CD133和vWF，即被培养的细胞表达特异性干细胞抗原和内皮细胞抗原，表明其为EPCs。　　 2、EPCs经bFGF和PBGF-BB诱导后其形态学变化在EPCs被诱导4天后，对照组细胞显示长的芽状突起；FICs呈现铺路石的表面；PICs形成梭形外观，且有呈束状排列的趋势。在8天后，NICs形成多个突起，而FICs显示短梭形；PICs形成“峰与谷”的排列。　　 3、免疫荧光检测EPCs在bFGF和PBGF-BB诱导下标记物的变化与NICs相比，FICs在第4天和第8天都有明显的内皮标记物(PECAM-1，vWF)荧光染色，而且第8天与第4天比，FICs的荧光强度更加明显；PICs在第4天和第8天都显示明显的平滑肌细胞(α-SMA，calponin)荧光染色，尤其在第8天，PICs显示了较强的平滑肌细胞标记物的表达；NICs对平滑肌细胞标记物和内皮细胞标记物(除PECAM-1外)表达一直是阴性的。　　 4、bFGF和PBGF-BB作用EPCs后，其分化相关蛋白的表达当细胞被诱导到第4天时，仍然有CD133的表达，但到第8天时，CD133的表达消失，这说明被诱导的细胞已经失去干/祖细胞的标记。对FICs而言，诱导前和诱导后都有PECAM-1的表达，但诱导后尤其是达到8天时，PECAM-1表达明显增强。同样对PICs来说，也逐渐显示出平滑肌细胞靶向蛋白α-SMA和calponin的表达，即与诱导前比，诱导至第4天时就有α-SMA和calponin的表达；诱导至第8天时，α-SMA和calponin的表达更加明显。　　 5、EPCs分化后超微结构变化与诱导前EPCs相比，FICs和PICs内细胞器结构发达，尤其是线粒体、内质网和高尔基复合体。但在FICs和PICs内并未见到Weibel-Palade小体和肌丝及密体结构。　　 6、bFGF和PDGF-BB分别诱导EPCs后，内皮细胞和平滑肌细胞标记物阳性的细胞百分率EPCs经bFGF作用后，具有内皮细胞标记vWF的细胞可达72.83％；而EPCs经PDGF-BB作用后，具有平滑肌细胞标记α-SMA的细胞可达68.36％，但在对照组中具有上述两种标记的细胞仅仅2％。　　 7、bFGF和PDGF-BB分别对内皮样细胞和平滑肌样细胞影响　　 (1)内皮样细胞和平滑肌样细胞增殖的能力相同浓度下，在0-48h期间，bFGF促进内皮样细胞和PDGF-BB促进平滑肌样细胞增殖的作用随时间延长而明显增强，并具有时间依赖性，同时也看到：bFGF和PDGF-BB在小剂量(相对于促进EPCs分化时的剂量而言)时就能促进上述2种细胞的增殖并且在一定范围内呈剂量依赖性，但bFGF在16ng/ml、PDGF-BB在18ng/ml时增殖达高峰。　　 (2)内皮样细胞和平滑肌样细胞迁移的能力相同浓度下，在0-48h期间，bFGF促进内皮样细胞和PDGF-BB促进平滑肌样细胞迁移的作用随时间延长而显著增加，并具有时间依赖性；同时也看到：在小剂量bFGF(2ng/ml)和PDGF-BB(3ng/ml)(相对于促进EPCs分化时的剂量而言)时就能促进上述2种细胞的迁移，并且在一定范围内呈剂量依赖性(三)内皮样细胞和平滑肌样细胞参与管腔形成的能力结果显示：内皮样细胞伸长并形成管腔，而平滑肌样细胞则呈弥漫排列，但将上述2种细胞混合接种后，则呈现明显的管腔形成。为了充分证明参与形成管腔的细胞及管腔的结构，将已标记的内皮样细胞和标记的平滑肌样细胞共同接种，结果发现：平滑肌样细胞与内皮样细胞形成了共同的血管网。　　 8、bFGF和PDGF-BB作用EPCs后PDGFRβmRNA表达bFGF和PDGF-BB作用EPCs后都会有PDGFRβmRNA的表达。bFGF作用组：PDGFRβmRNA在各时间点均有表达且与对照组比均有显著差异，当bFGF作用60min时表达量开始明显增加，且在180min时最显著。PDGF-BB作用组：PDGFRβmRNA在各时间点也均有表达，与对照组比较，PDGFRβmRNA表达的差异具有统计学意义，相邻时间点的进行比较差异均也比较显著。　　 9、EPCs分化相关的PLC-γ和p-ERK表达Western blot法检测bFGF和PDGF-BB分别作用EPCs30min、60min和90min后PLC-γ和p-ERK的表达。结果显示，bFGF和PDGF-BB作用EPCs后均有PLC-γ、p-ERK的表达。bFGF作用组和PDGF-BB作用组：PLC-γ、p-ERK表达与对照组比均有显著差异，且在一定范围内随时间增加而逐渐增多。　　 10、bFGF和PDGF-BB作用EPCs后VEGF的表达ELISA检测结果显示：EPCs在bFGF作用下可以产生VEGF，且在一定范围内随时间的增加而增多，在PDGF-BB组VEGF也在一定范围内出现时间依赖性增加，但是较bFGF诱导组增加的少。　　 结论:　　 1、bFGF可以诱导大鼠EPCs向内皮方向分化。　　 2、PDGF-BB可以诱导大鼠EPCs向平滑肌方向分化。　　 3、内皮样细胞和平滑肌样细胞可以增殖、迁移和形成共同的血管网。　　 4、bFGF可以促进大鼠EPCs的PDGFRβmRNA转录。　　 5、bFGF和PDGF-BB可能通过启动大鼠EPCs中PLC-r和p-ERK途径而发挥作用。　　 6、bFGF促进大鼠EPCs分化为成熟内皮的作用可能主要是通过增加VEGF的分泌而实现的。　　 7、PDGF-BB促使大鼠EPCs分泌VEGF，可能会保证其诱导成的平滑肌样细胞参与内皮样细胞构建的血管网