脂肪组织能分泌多种蛋白质激素和细胞因子(统称脂肪因子,Adipokines)。肥胖时脂肪组织分泌的脂肪因子谱发生变化,如脂联素(Adiponectin)分泌减少,内脂素(Visfatin)、瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)分泌增加,并伴随着脂肪炎症因子如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)等分泌增加,最终的结果是导致胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR),增加了代谢综合征(Metabolic Syndrome, MS)、2型糖尿病和心血管疾病的发病风险。以脂肪因子为切入点研究肥胖和MS的关系已成为当前的研究热点。过氧化物酶增殖物活化受体γ(Peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPAR、)选择性地在脂肪组织中高表达,因其对胰岛素敏感性的调节而备受瞩目。众多的脂肪因子如Adiponectin、Visfatin、TNF-α和IL-6等的表达均受到PPARγ转录调节,激活PPARγ增加胰岛素敏感性的机制主要与其调节脂肪因子的产生有关。肝X受体(Liver X receptors, LXRs)也在脂肪组织高表达,其在调节糖、脂代谢方面的作用与PPARγ存在重叠,但其对脂肪因子表达的作用未见报道。在肝细胞中发现,LXRs激动能够抑制PPARα信号通路进而抑制脂肪酸分解代谢相关基因的表达。但在脂肪细胞中,LXRs激动是否影响PPARγ转录调节脂肪因子的表达尚无研究。基于脂肪因子与IR的密切关系以及PPARγ在调节脂肪因子表达中的重要地位,研究LXRs激动对PPARγ转录调节脂肪因子表达的作用及机制,对于评价LXRs对机体胰岛素敏感性的作用以及LXRs激动剂作为拮抗MS新型药物的前景具有重要意义。第一部分LXRs激动对PPARγ转录调节脂肪因子表达的作用目的：观察LXRs激动及LXRα表达敲低对PPARγ转录调节脂肪因子表达的作用。方法：将3T3-L1前脂肪细胞经标准"Cocktail"诱导分化为成熟脂肪细胞。首先利用Real-time RT-PCR和Western blot方法观察了脂肪细胞分化过程中LXRs和PPARγ的表达变化；其次在成熟脂肪细胞中利用Real-time RT-PCR、Western blot和ELISA法观察了PPARγ激动剂Pioglitazone 3μM存在或不存在时,LXRs激动剂T0901317以0、0.1、1.0和10.0μM浓度梯度刺激脂肪细胞对PPARγ转录调节脂肪因子Adiponectin、Visfatin以及LPS 2μg/ml刺激诱导的脂肪炎症因子TNF-α和IL-6表达和分泌的作用,并观察了以逆转录病毒介导的shRNA-LXRα转染特异性敲低LXRα表达后上述脂肪因子表达的变化；最后以Real-time RT-PCR和Western blot方法研究了LXRs激动对PPARγ基因本身表达的作用。结果：(1)在脂肪细胞分化成熟过程中,PPARγ和LXRa mRNA和蛋白表达水平逐渐增加,在诱导第4日(DAY 4),二者的表达较诱导前有显著增加(P<0.05 VS DAY 0)至诱导第8-10日达到高峰,而LXRβ表达水平在诱导分化过程中无明显变化；(2)T0901317浓度依赖性地抑制Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表达,并浓度依赖性地拮抗了Pioglitazone诱导的Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表达增加,在1.0及10.0μM作用显著(P<0.05 VS DMSO/Pioglitazone)；但在脂肪炎症因子的表达上,T0901317浓度依赖性地下调了LPS刺激诱导的TNF-α和IL-6mRNA表达和蛋白分泌,同时加入Pioglitazone,TNF-α和IL-6mRNA表达和蛋白分泌在T0901317各浓度点均进一步下降,在T0901317在1.0及10.0μM浓度与Pioglitazone的协同抑制作用最显著(P<0.05 VS LPS/LPS+Pioglitazone);(3)LXRα表达敲低后,在T0901317各浓度点,Pioglitazone诱导的Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表达进一步上调(P<0.05 VS shRNA-Control+Pioglitazone组),但尽管存在Pioglitazone, LPS刺激诱导的TNF-α和IL-6的mRNA表达和蛋白分泌在T0901317各浓度点均增加(P<0.05 VS shRNA-Control+Pioglitazone+LPS组)；(4)T0901317在1.0和10.0μM能上调PPARy mRNA和蛋白表达水平(P<0.05 VSDMSO).结论：在成熟脂肪细胞中,LXRs激动能拮抗PPARγ转录激活脂肪因子Adiponectin和Visfatin表达,但协同PPARγ对脂肪炎症因子TNF-α和IL-6表达的转录抑制作用,前者可能对胰岛素敏感性不利,而后者则可能改善胰岛素敏感性。对LXRs激动剂来说,如何趋利避害是亟待解决的问题,而这需要我们对LXRs激动如何影响PPARγ转录调节脂肪因子表达的机制作深入研究。第二部分LXRs激动影响PPARy转录调节脂肪因子表达的机制研究目的：明确LXRs激动拮抗PPARγ转录激活活性,但协同PPARy抑制炎症介质产生的主要机制。方法：利用启动子报告基因PPRE-Luc和KB-Luc活性分别代表PPARγ转录激活活性和NF-KB的转录活性。利用质粒共转染技术和凝胶迁移滞后试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMS A),观察HEK293细胞中LXRα、PPARγ. PPRE-LucKB-Luc质粒共转染及T0901317浓度梯度刺激对PPRE-Luc和KB-Luc活性的影响以及脂肪细胞中LXRs激动或LXRα表达敲低对PPARγ和NF-KB的DNA结合活性的作用；并予RXRα(维甲酸X受体α)表达质粒转染,观察补充RXRα是否能逆转LXRs激动对PPARγ转录激活活性以及PPARγ转录激活脂肪因子表达的拮抗作用；并在脂肪细胞中以Western blot法观察LXRs激动或LXRα表达敲低对LPS刺激的NF-KB信号通路活性的作用。结果：(1)在HEK293细胞中,T0901317浓度依赖性地拮抗了PPARy及其激动剂Pioglitazone诱导的PPRE-Luc活性增加(P<0.05 VS DMSO/Pioglitazone),但能浓度依赖性地协同Pioglitazone对KB-Luc活性的抑制作用,在1.0和10.0μM作用显著(P<0.05 VS LPS+ Pioglitazone);(2)在脂肪细胞中,T0901317拮抗了Pioglitazone诱导的PPARγ与PPRE结合活性增加,但协同了Pioglitazone对NF-KB的DNA结合活性的抑制作用；LXRα表达敲低后,Pioglitazone诱导的PPARγ与PPRE的结合活性进一步增加,但Pioglitazone和T0901317对NF-KB的DNA结合活性的协同抑制作用降低；(3)补充RXRα能够逆转LXRs激动对PPRE-Luc活性的抑制作用,并基本恢复脂肪细胞中Adiponectin和Visfatin mRNA和蛋白表达(P<0.05 VS pcDNA3.1);(4)在脂肪细胞中,Pioglitazone和T0901317能够单独或协同抑制LPS刺激的IKBα磷酸化和磷酸化NF-κBp65核转位(P<0.05 VS LPS),进而抑制NF-κB通路活性；LXRa表达敲低后,Pioglitazone和T0901317对NF-KB通路活性的协同抑制作用明显降低(P<0.05 VS shRNA-Control).结论：脂肪细胞中LXRs激动主要通过竞争RXRα拮抗PPARγ转录激活活性,进而抑制PPARγ转录激活脂肪因子表达,补充RXRα能基本逆转此种拮抗作用；而LXRs与PPARγ激动能协同抑制成熟脂肪细胞NF-KB信号通路活性,进而协同抑制脂肪炎症因子表达。同时补充RXRα受体或予激动,有可能使LXRs激动剂最大程度发挥胰岛素增敏作用。