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背景:慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)是原发性、继发性肾脏疾病所致的渐进性肾损害时出现的一系列临床综合征[1],属于临床上的难治性疾病,且预后极差。既往临床研究发现隔药饼灸可以改善早中期CRF患者的症状及肾功能指标,最终提高患者生活质量及延缓CRF进程[2],但其内在机理尚未明确。国内外研究发现各种慢性肾脏疾病发展成终末期肾衰竭时均与肾间质纤维化密切相关,而肾间质纤维化最重要的通路便是TGF-β1/Smads信号转导通路[3]。因此,我们提出假设:隔药饼灸防治CRF的可能机制是通过调节TGF-β1/Smads信号转导通路相关因子,使之达到“动态平衡”的状态,从而抑制肾纤维化的发生发展,达到治疗、延缓慢性肾衰竭的作用。因此,本实验希望通过研究隔药饼灸对CRF模型兔TGF-β1/Smads信号转导通路中正反馈因子TGF-β1、Smad3、CTGF、ILK及负反馈因子BMP-7、Smad7的表达,探讨隔药饼灸防治CRF的机制,从而提高隔药饼灸治疗CRF的临床指导价值及运用价值,并为中医外治疗法治疗CRF提供新的理论依据。同时,本实验也是国家自然科学基金项目“从TGF-β1/Smads信号通路探讨隔药饼灸干预慢性肾衰竭兔的机制研究”(8166150111)的部分内容。目的:通过观察隔药饼灸治疗CRF兔常规检查(血压、体重、血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白)的变化及TGF-β1/Smads信号转导通路中TGF-β1、Smad3、CTGF、ILK、Smad7、BMP-7mRNA及蛋白表达水平的变化,探讨隔药饼灸对TGF-β1/Smads信号通路的影响,为临床运用隔药饼灸治疗CRF提供理论和实验依据。方法:选用体重在1.8kg2.2kg的清洁级雄性健康新西兰兔30只,适应性饲养1周。随机选6只为A组(空白组),其余给予为期3周的腺嘌呤造模。造模成功后,随机分为B组(模型组)、C组(氯沙坦钾组)、D组(隔药饼灸组)、E组(隔药饼灸+抑制剂组),每组6只,并予检测各组兔的血压、体重、血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白。随即给予相应治疗3个疗程(共计36天),再次检测血压、体重、血肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白。处死后行肾脏病理切片HE染色及Masson染色,观察肾组织的病理改变情况;采用Q-PCR、Western blotting测定正反馈因子TGF-β1、Smad3、CTGF、ILK及负反馈因子Smad7、BMP-7 mRNA及蛋白的表达水平;采用ELISA法检测CRF家兔血清TGF-β1、CTGF、BMP-7蛋白表达水平;采用免疫组织化学方法检测肾组织中TGF-β1、Smad3的表达水平。结果:1.对体重、血压的影响体重方面:造模后与空白组对比,其余各组家兔的体重明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比,各干预组家兔的体重差异不具有统计学意义(P>0.05)。实验结束时与空白组对比,模型组体重明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组及隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组体重上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。与氯沙坦钾组、隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组体重不具统计学意义(P>0.05)。血压方面:造模后与空白组对比,其余各组收缩压、舒张压、平均动脉压明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组收缩压、舒张压、平均动脉压差异不具有统计学意义(P>0.05)。实验结束时与空白组对比,模型组收缩压、舒张压、平均动脉压升高,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组收缩压、舒张压、平均动脉压明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。隔药饼灸组收缩压、平均动脉压明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),但舒张压差异不具有统计学意义(P>0.05)。隔药饼灸+抑制剂组收缩压、舒张压、平均动脉压尽管有下降的趋势,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组收缩压、平均动脉压明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),舒张压差异不具有统计学意义(P>0.05)。与氯沙坦钾组对比,隔药饼灸组收缩压、舒张压、平均动脉压差异不具有统计学意义(P>0.05)。2.对血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24h尿蛋白的影响造模后与空白组对比,其余各组Scr、BUN、24h尿蛋白明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组Scr差异不具有统计学意义(P>0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组Scr、BUN、24h尿蛋白差异不具有统计学意义(P>0.05)。实验结束时与空白组对比,模型组Scr、BUN、24h尿蛋白明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组Scr、BUN降低,差异具有统计学意义(P<0.01),隔药饼灸+抑制剂组Scr、BUN差异不具有统计学意义(P>0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组24h尿蛋白差异具有统计学意义(P<0.05),而隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组24h尿蛋白不具有统计学意义(P>0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组Scr、BUN差异具有统计学意义(P<0.01),与氯沙坦钾组对比,隔药饼灸组Scr、BUN不具有统计学意义(P>0.05)。与隔药饼灸组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸+抑制剂组24h尿蛋白不具有统计学意义(P>0.05)。3.组织病理形态学结果HE染色结果:空白组肾小球、肾小管结构完整,毛细血管结构,肾间质结构正常,纤维组织增生不明显。模型组肾小球、肾间质充血,毛细血管结构破坏,肾小管肿大,管腔间隙狭窄,上皮细胞变性、肿大,纤维组织增生明显。其它各组可见不同程度的肾小球、肾间质充血,肾小管肿大,上皮细胞变性,纤维组织增生等情况较之于模型组均有所减轻。Masson染色结果:空白组肾小管基底膜、小血管周围及肾间质可见少量胶原分布。模型组肾间质管腔明显增宽,肾间质、毛细血管周围纤维因增生而出现明显的蓝色。其余各组均能清楚观察到肾间质管腔不同程度增宽、胶原纤维不同程度增生的情况,但较之于模型组均有所减轻。4.对TGF-β1、Smad3、ILK、CTGF、Smad7、BMP-7 mRNA表达水平的影响与空白组对比,模型组TGF-β1、Smad3、ILK、CTGF mRNA表达量升高(P<0.01或P<0.05),Smad7、BMP7mRNA表达量降低(P<0.01或P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的TGF-β1mRNA表达量下降(P<0.05),与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组TGF-β1mRNA表达量下降(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的Smad3 mRNA表达量下降(P<0.01),而隔药饼灸+抑制剂组的Smad3 mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组Smad3 mRNA表达量降低(P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的ILK mRNA表达量显著下降(P<0.01),而隔药饼灸+抑制剂组的ILK mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组的ILK mRNA表达量下降(P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组的CTGF mRNA表达量下降(P<0.01或P<0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组CTGF mRNA表达量下降(P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的Smad7 mRNA表达量升高(P<0.01或P<0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组Smad7 mRNA表达量升高(P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的BMP-7mRNA表达量升高(P<0.01或P<0.05)。与氯沙坦钾组、隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组BMP-7mRNA表达量差异不显著(P>0.05)。5.对血清TGF-β1、CTGF、BMP-7蛋白水平的影响与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的TGF-β1蛋白表达显著下调(P<0.01),与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组TGF-β1蛋白表达量显著下降(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的CTGF蛋白表达量显著下降(P<0.01),与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组CTGF蛋白表达量降低(P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的BMP-7蛋白表达量升高(P<0.01),而隔药饼灸+抑制剂组差异不显著(P>0.05);与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组BMP-7蛋白表达升高(P<0.01)。6.TGF-β1、Smad3、ILK、CTGF、Smad7、BMP-7蛋白表达水平的影响(1)免疫组化法检测肾组织TGF-β1、Smad3的表达空白组肾组织TGF-β1、Smad3少量表达,为淡黄色;模型组TGF-β1、Smad3表达上调(P<0.05),为黄褐色。与模型组相比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组、隔药饼灸+抑制剂组的TGF-β1蛋白表达显著下调(P<0.01)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组TGF-β1蛋白表达量显著下降(P<0.01)。与模型组对比,各干预组的Smad3表达量显著下降(P<0.01)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组Smad3表达量显著下降(P<0.01)。(2)Western blot检测TGF-β1、Smad3、ILK、CTGF、Smad7、BMP-7蛋白表达与空白组对比,模型组TGF-β1、Smad3、ILK、CTGF蛋白表达量升高(P<0.01或P<0.05),Smad7、BMP7蛋白表达量降低(P<0.01或P<0.05)。其中,与模型组对比,各干预组的TGF-β1蛋白表达量下降(P<0.01)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组TGF-β1蛋白表达量下降(P<0.01)。与模型组对比,各干预组的Smad3蛋白表达量下降(P<0.01)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组的Smad3蛋白表达量下降(P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组ILK蛋白表达量下降(P<0.01)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组ILK蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的CTGF蛋白表达量下降(P<0.01或P<0.05)。与模型组对比,氯沙坦钾组、隔药饼灸组的Smad7蛋白表达量升高(P<0.01或P<0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组Smad7蛋白表达量差异不具有统计学意义(P>0.05)。与模型组对比,各干预组的BMP-7蛋白表达量升高(P<0.05)。与隔药饼灸+抑制剂组对比,隔药饼灸组的BMP-7蛋白表达量升高(P<0.05)。结论:通过隔药饼灸改善CRF兔症状、体征、增加体重、降低血压(收缩压及平均动脉压)、降低血清Scr及BUN水平,减少24h尿蛋白排泄的趋势,证实隔药饼灸对CRF兔有良好的治疗作用。通过隔药饼灸调节正反馈因子TGF-β1、Smad3、CTGF、ILK及负反馈因子Smad7、BMP-7 mRNA及蛋白的表达水平,证实隔药饼灸抗CRF肾间质纤维化与TGF-β1/Smads信号通路相关,从而提高了隔药饼灸治疗CRF的临床指导价值及运用价值,也为中医外治疗法治疗CRF提供新的思路与依据。