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3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-trichloro-2-pyridinol, TCP)是除草剂绿草定和杀虫剂毒死蜱及甲基毒死蜱的主要降解产物,广泛存在于环境中。在土壤中,由于TCP比毒死蜱吸附性差而稳定性和水溶性强,所以有着更强的渗透性。食入TCP对人体有危害,TCP尤其会对眼睛造成严重的损害,此外TCP对水生和陆生生态区有着低到中度的毒害作用,对生态系统影响较大。虽然通过物理和化学方法可降解TCP,但相比之下由于TCP微生物降解具有高效性,低成本,环境友好型等特点,使其在TCP环境污染治理方面更具有潜力。到目前为止,有关TCP微生物降解报道较少,因此分离和丰富TCP降解菌种资源具有十分重要的意义,本研究通过富集培养的方法分离得到一株TCP降解菌T6,然后对其进行了菌种鉴定及降解特性和降解机制研究。从污水处理池中采得活性污泥样品,通过富集培养的方法分离得到一株稳定的3,5,6-三氯-2-吡啶醇(TCP)降解菌T6。菌株T6为一短杆状的革兰氏阴性菌,结合对菌株T6进行的16S rRNA基因序列比对和系统进化树分析,将其初步鉴定为Ralstonia sp. strain T6。Ralstonia sp. strain T6对TCP具有高效的降解速率,能够在1h内将10mg/LTCP完全降解,在12h内将100mg/L TCP完全降解,在80h内将700mg/L TCP完全降解。Ralstonia sp. strain T6降解TCP的最适pH值和最适温度分别为8和30℃。K+对Ralstonia sp. strain T6降解TCP有促进作用；Fe3+、Ca2+、Mg2+、Mn2+对TCP降解没有明显的影响；Zn2+、Co2+、Ni2+对TCP降解有明显的抑制作用；Cu2+则完全抑制Ralstonia sp. strain T6对TCP的降解。利用硝酸银滴定法,液相色谱——质谱联机等检测手段将TCP降解过程中产生的绿色中间体初步鉴定为3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。通过简并引物从Ralstonia sp. strain T6的基因组中成功扩增出利用FADH2的单加氧酶基因(tcpA)的部分序列,利用基因打靶技术将tcpA插入失活,突变菌株(T6-ΔtcpA)失去了降解TCP的能力但仍能够降解绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。推测Ralstonia sp. strain T6中参与TCP降解起始的基因位于tcpA基因序列的上下游。利用SEFA PCR技术扩增tcpA的侧翼序列,克隆到一段由3个基因组成的tcp基因簇。将tcp基因簇中的3个ORF分别命名为基因tcpR,tcpX和tcpA,长度分别为972bp,552bp和1554bp,其中TcpR和TcpX分别与LysR家族转录调节因子(LysR family transcriptional regulator)和黄素还原酶(flavin reductase)有着较高的一致性,黄素还原酶可将NAD(P)H中的H传递给FAD而生成FADH2。随后通过对突变体T6-ΔtcpA中插入失活的基因tcpA进行功能互补实验验证了互补菌株T6-ΔtcpA-com恢复了对TCP的降解功能,说明菌株T6中的tcpA基因确实为TCP降解起始阶段的关键基因,TcpA催化TCP生成绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。同时TcpA为依赖于FADH2的单加氧酶,因此推测在TcpA催化TCP降解过程中TcpX发挥着黄素还原酶的功能,为TcpA反应提供所需的FADH2,而TcpR对降解起着调节作用。通过对菌株T6进行随机插入失活突变子文库构建,成功筛选出4个突变子,在功能上都已不能降解绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮。通过侧翼序列扩增,得到了一段长约5.9kb的片断。经过序列分析,认为这一段序列中的4个基因组成了菌株T6中进一步降解绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮的thp基因簇。将thp基因簇中的4个ORF分别命名为基因thpR, thpI, thpJ和thpK,长度分别为900bp,717bp,879bp和1251bp。通过构建异源重组表达载体和诱导表达的方法分别检测ThpJ和ThpI的粗酶液活性,结果发现ThpJ对绿色中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮有很好的降解活性,能将其完全降解并生成一种新的中间体5-氧基-2,4,5-三羰基正戊酸；而ThpI能将5-氨基-2,4,5-三羰基正戊酸进一步进行降解,可以看出ThpJ和ThpI能够先后对TCP降解中间体3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮进行有效的降解。同时根据蛋白质序列同源性分析,推测ThpR和ThpK分别在thp降解基因簇中起着调节和物质运输的功能。综上所述,菌株T6中TCP降解相关基因簇tcp基因簇和thp基因簇能够先后对TCP进行有效降解,其中tcp基因簇主要负责TCP降解初始阶段绿色中间体3,6--羟基吡啶-2,5-二酮的生成,thp基因簇能够对3,6-二羟基吡啶-2,5-二酮进行进一步的有效降解,从而实现菌株T6对TCP的彻底降解。