目的:牙齿是口腔颌面部的重要组织结构,牙齿的缺失不仅影响面部的美观,还对咀嚼和发音等造成不良影响。目前对于缺失牙多以义齿或种植牙修复。近年来组织工程学的发展为组织器官的修复开辟了一条新的途径,牙齿的组织工程学研究也不断的深入。作为包括牙齿在内的多种组织工程的种子细胞,骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）是近年来的一个研究热点。本文将牙齿发育相关蛋白牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1, DMP1）基因转染小型猪的BM-MSCs后,观察其形态的变化并将转染细胞以悬液的形式异位植入自体和异体宿主的股部肌肉内,2个月后取材组织学及免疫学观察其分泌基质及矿化的能力,为其今后作为种子细胞构建组织工程化牙齿提供实验依据。方法:1猪BM-MSCs体外分离与培养中国农业大学实验动物研究所购买10月龄中国实验小型猪两只,分别编号为P-Ⅰ、P-Ⅱ。3%戊巴比妥钠耳后肌肉麻醉,用16号穿刺针于股骨大转子处穿刺,抽取骨髓4ml,置于肝素化的25ml无菌培养液中,1000r/min离心10min,弃上清,在含10%FBS的DMEM,37℃5%CO₂饱和湿度条件下培养。5天后全量换液,以后每周2次换液。两只实验动物的骨髓间充质干细胞分别命名为Ⅰ-BM-MSCs、Ⅱ-BM-MSCs。2 BM-MSCs的表型鉴定通过流式细胞仪检测细胞CD34、CD38、CD45、HLA-DR、CD90、CD44、CD147表面抗原表达（委托河北医科大学第四医院肿瘤研究所）。3 DMP1基因转染及筛选第三代细胞用于基因转染。转染前用含10%FBS的DMEM调整细胞浓度至1×10⁵接种于6孔板中,CO₂孵箱培养至60%融合。采用脂质体介导方法将DMP1基因转染至BM-MSCs。48小时后,按1:10稀传至大培养瓶中,加入G418 500μg/ml进行筛选,同时以未转染细胞作为对照。每4天换液1次。14天后未转染的细胞死亡,转染的细胞克隆生长,扩大培养备用。转染后的细胞分别命名为Ⅰ-BM-MSCs- DMP1、Ⅱ-BM-MSCs- DMP1。4转染细胞的免疫组织化学检测将筛选后的细胞Ⅰ-BM-MSCs- DMP1、Ⅱ-BM-MSCs- DMP1培养于6孔板的玻片上,免疫组织化学SP法染色检测DMP1、牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein, DSP）的表达,抗体滴度为1 :200。同时以未转染的细胞作为对照。5转染细胞肌肉内异位植入植入前分别收集Ⅰ-BM-MSCs- DMP1、Ⅱ-BM-MSCs- DMP1,并制备成细胞的PBS混悬液,调整浓度至1×10⁷/ml。采用注射植入的方法,每一肢体注射四个位点,每点注射200μl。具体情况如下:编号为P-Ⅰ的小型猪的左、右下肢股部近心端内侧肌肉内分别植入Ⅰ-BM-MSCs- DMP1（自体组）、Ⅱ-BM-MSCs- DMP1（异体组）;编号为P-Ⅱ的小型猪的左、右下肢股部近心端内侧肌肉内分别植入Ⅰ-BM-MSCs- DMP1（异体组）、Ⅱ-BM-MSCs- DMP1（自体组）。6标本取材及组织学和免疫组织化学观察2个月后处死实验动物,并切取细胞植入部位的肌组织,立即置于福尔马林中固定。之后进行组织学染色观察植入细胞的情况,是否有牙本质样钙化形成。并用免疫组织化学SP法染色检测DSP的表达。结果:1成功分离并培养出BM-MSCs,流式细胞检测显示为间充质干细胞来源。2通过脂质体方法成功将DMP1基因转染至BM-MSCs,免疫组织化学染色结果显示转染后的细胞DMP1、DSP呈阳性表达。3自体植入组组织学显示植入细胞在体内分泌基质并矿化,有类牙本质样结构形成。免疫组织化学显示埋入矿化组织内的细胞部分DSP呈阳性表达。4异体植入组组织学显示植入部位出现明显的炎症反应,中央区域组织坏死,周围被结缔组织包绕,其内可见散在分布的植入细胞,这些细胞免疫组织化学染色DSP呈阳性表达。但细胞并未表现出基质分泌活性。结论:1 BM-MSCs易于获得并体外培养,并可通过脂质体基因转染方法获得DMP1基因转染的骨髓间充质干细胞BM-MSCs- DMP1。2体内实验结果表明自体BM-MSCs- DMP1可作为牙齿组织工程的种子细胞,而异体BM-MSCs- DMP1因为有明显炎症反应而需要进一步研究。