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目的:生命材料的生物化是再生医学研究中需要解决的重要的关键性问题,是生物材料的研发方向。胶原蛋白及纤连蛋白为细胞外基质(ECM)重要组成部分,作为可降解生物材料在再生医学中广泛应用。但存在动物来源易发生免疫排斥,提取工艺中存在质量难以控制和环境污染等风险,对二者进行结构改造获得更优异性能的再生医学材料是当前研究热点本研究基于纤连蛋白和胶原蛋白各自特性,设计了一种新颖的重组人源纤连蛋白和胶原蛋白的融合蛋白(FNC),增强了其对干细胞的粘附和定植功能,可开发成一种可植入的再生医学材料。方法:(1)酵母密码子优化后全基因合成构建了p PICZαA-FNC-his和p PICZαA-FN10-his重组质粒,转化到毕赤酵母表达体系进行重组表达和纯化。通过表达菌株及表达条件的筛选和优化,获得高表达FNC和FN10(融合蛋白的纤连蛋白片段,为后续实验中的对照品)的工程菌株X33。Ni-NTA Sepharose亲和层析柱纯化。并进行了2L规模放大工艺的研究。(2)基于折叠识别法(穿线法)预测FNC蛋白质二级结构,通过PSIPRED 4.0(Predict Secondary Structure)预测二级结构,与细胞整合素β3进行蛋白对接(ZDOCK对接,对接结果用IRa PPA优化排名),预测其细胞结合能力。(3)原代提取BMSCs(大鼠骨髓间充质干细胞)并进行多向分化能力鉴定和整合素β3的表达验证,以此细胞为模型细胞采用结晶紫染色法,共聚焦显微镜结合免疫荧光观察,划痕实验对比研究了FNC、FN10和CP(胶原片段)对BMSCs增殖和粘附行为的影响。结果:(1)构建了p PICZαA-FNC和p PICZαA-FN10两个重组表达载体,并成功获得两株工程菌,分别是X33/FNC和X33/FN10。同时对重组蛋白人源FNC和FN10表达条件进行选择和优化,结果表明,博来霉素没有明显的筛选性,适合FNC表达的培养基为YPM培养基,最佳的诱导甲醇终浓度为1.0%,最佳的诱导时间为72h,HPLC结果显示FNC纯度达到96%,FN10纯度达到97%,LC-MS/MS对FNC精确分子量测定得到FNC的分子量为33.87k Da,与理论值一致。通过2L体系放大培养,FNC的表达量占总蛋白的63.65%,发酵液p H稳定在7.2左右,为规模化生产奠定了基础。(2)采用穿线法建模,成功模拟FNC和整合素β3的结构,用软件ZDOCK进行FNC和整合素β3分子对接,对接结果显示:FNC中的FN10与整合素β3相互作用形成比较稳定的复合物。(3)提取分离的BMSCs细胞经流式细胞仪鉴定表型,BMSCs具有成脂和成骨多向分化的能力。利用此细胞研究了各蛋白促MSC粘附和迁移的生物学性能,相比于FN10和CP,FNC具有更强的促MSC粘附作用和迁移能力。结论:本研究成功地应用毕赤酵母X33系统表达了一种新的人源FNC融合蛋白和人源FN10蛋白,并进行了正确性验证,二者的HPLC纯度>95%。相比于融合蛋白的独立片段,FNC以β3整合素为介导,显著促进了原代BMSCs细胞的粘附和迁移。作为一种新的类ECM外基质蛋白,FNC有被进一步研究的潜力。