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【研究背景】促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种高度糖基化的蛋白质,通过与其受体相互作用刺激红细胞生成。EPO和其受体共同表达与多种肿瘤中,并且与肿瘤细胞的生长迁移相关。肺癌发病率和致死率在所有癌症中均居首位,其中绝大多数肺癌属于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC),NSCLC治疗预后效果不佳。有研究证实EPO/EPOR共同表达于NSCLC中,但是EPO/EPOR能否作为非小细胞肺癌一个潜在的预后指标,仍存在争论,且EPO/EPOR对NSCLC的发生发展具有什么样的作用以及其分子机制均有待进一步阐明。【研究目的】本课题拟通过对非小细胞肺癌的临床样本分析,明确EPO/EPOR高表达对NSCLC的临床意义;通过体外细胞实验及体内动物实验,系统阐明EPO/EPOR在非小细胞肺癌发生发展中的作用及相关分子机制,为非小细胞肺癌的研究提供新理论,也为红细胞刺激剂类药物在NSCLC肿瘤相关性贫血治疗中的危险性研究提供理论依据。【方法】1.我们首先通过免疫组织化学实验检测60例非小细胞肺癌组织标本和150例NSCLC组织芯片中EPO/EPOR的表达情况,结合患者临床病理资料和生存期情况,通过统计学方法系统评价EPO/EPOR与肿瘤分期及患者预后的关系;2.收集35例NSCLC患者和15例志愿者的血清,利用ELISA实验观察EPO的表达情况同时检测患者实施肿瘤摘除手术后EPO的变化情况;通过WB和qRT-PCR实验检测患者肿瘤组织中EPO的表达情况;通过肿瘤细胞原代培养及构建PDX小鼠模型,明确EPO/EPOR双阳性NSCLC肿瘤组织能否分泌EPO;3.通过WB和qRT-PCR实验检测NSCLC细胞系中EPO/EPOR的表达水平;使用EPO中和抗体和瞬时转染EPOR siRNA,利用MTT实验体外观察EPO对非小细胞肺癌细胞增殖的影响;4.运用流式细胞术及Transwell实验检测EPO对非小细胞肺癌细胞凋亡、侵袭和周期的作用;5.应用ChIP(chromatin immunoprecipitation)、报告基因实验及WB实验进一步明确EPO促进EPO/EPO双阳性NSCLC细胞周期的分子机制;6.利用通过稳定转染EPOR shRNA技术构建EPOR敲除的NSCLC细胞系,结合裸鼠皮下注射实验,体内观察肿瘤分泌EPO对非小细胞肺癌细胞增殖的影响;7.通过缺氧条件暴露细胞,运用EPO中和抗体和瞬时转染EPOR siRNA,观察缺氧环境对肿瘤分泌EPO及NSCLC细胞增殖的影响。【结果】1.EPO/EPOR共同表达于NSCLC组织中,有吸烟史患者EPO水平显著高于无吸烟史患者,临床NSCLCⅢ期及Ⅳ期患者EPO水平显著高于Ⅱ期,且EPO/EPOR强阳性表达与患者5年生存期呈负相关;2.在收集的35例非小细胞肺癌患者血清中,14例EPO水平显著升高,在肿瘤切除后降至正常水平;此外14例患者肿瘤组织中EPO/EPOR的表达均高于其余21例患者,来源于14例患者肿瘤组织的原代细胞培养上清中EPO水平也明显高于其余21例,在由EPO强阳性表达肿瘤组织构建的PDX小鼠模型中,其血清EPO的水平明显高于低表达组;3.EPO/EPOR在NSCLC细胞系H1155、H1833、H1819、H3122中高表达,而在HCC15、A549、H2073、H44、H1993等细胞系中低表达;EPO能够促进EPO/EPOR强阳性表达NSCLC细胞增殖;4.EPO能够促进EPO/EPOR强阳性表达NSCLC细胞周期由G1期向S期分化,但对细胞侵袭和抗凋亡等功能并无明显作用;5.rhEPO通过Jak2/Stat5通路上调Cyclin D1进而促进EPO/EPOR双阳性NSCLC细胞周期;6.在移植瘤小鼠模型中,局部使用EPO中和抗体或运用干涉技术,均能有效抑制EPO/EPOR双阳性NSCLC细胞的生长,同时延长小鼠的生存期;7.在EPO/EPOR双阳性NSCLC细胞中,缺氧环境通过HIF-1α诱导肿瘤内源性EPO的分泌表达。【结论】1.本研究通过非小细胞肺癌临床样本和组织芯片分析以及患者病理资料分析,证实EPO/EPOR的表达与NSCLC分期正相关,与患者预后负相关;2.证实EPO/EPOR双阳性的NSCLC患者肿瘤能够分泌EPO,肿瘤分泌的EPO能够通过肿瘤表面EPOR促进EPO/EPOR双阳性NSCLC的发生发展;3.EPO可以通过EPOR/Jak2/Stat5a/cyclin D1通路促进NSCLC细胞增殖;4.明确在NSCLC治疗中靶向EPO信号传导的可能性,并且当rhEPO用于治疗化学疗法相关的贫血时,建议阻断肿瘤区域中EPOR的表达进而可能使患者从治疗中受益。5.肿瘤微环境中低氧应激可以诱导自分泌EPO/EPOR信号传导,从而促进NSCLC细胞增殖。6.本论文的研究结果提示了红细胞刺激剂类药物在NSCLC肿瘤相关性贫血治疗中的危险性。