论文部分内容阅读
本课题组从华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库的EST序列中，识别出了编码cathepsin L样蛋白的全长cDNA序列。本论文以该基因及其编码蛋白为研究对象，主要研究其生物学特性，依此评价它在免疫诊断和疫苗研究方面的应用前景，给肝吸虫病的诊断和防治提供更多的新思路和方法。
目的和意义：
基于蠕虫在寄生虫营养代谢、免疫逃避、毒力、组织细胞入侵、脱包囊/包囊形成中发挥的关键性作用，是免疫诊断、疫苗研制和药物筛选的理想分子；而目前对cathepsin L在肝吸虫与宿主相互关系中的作用缺乏全面认识，因此从本课题组已构建的华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库中，寻找华支睾吸虫的cathepsin L，识别出该酶基因的全长cDNA编码序列。对原核表达的重组CsCatL蛋白进行基本生物学特性研究，依此评价它在免疫诊断和疫苗研究方面的应用前景，给肝吸虫病的诊断和防治提供更多的新思路和方法。
方法：
1.CsCatL基因的生物信息学分析
通过BLASTx方法搜索GenBank中其他物种的同源序列，并进行多序列同源性比对，分析该蛋白的分子进化规律；并利用生物信息学技术对CsCatL的拓扑结构、抗原表位、功能域、以及蛋白质三级结构等基本结构和功能特征进行全面的分析和预测，用于指导实验研究。
2.CsCatL基因的克隆表达和重组蛋白的纯化和复性
针对所预测的蛋白结构特征，应用分子克隆技术分别构建CsCatL的前体蛋白、前体肽和成熟肽三个片段的pET—28a原核表达质粒，在大肠杆菌中以包涵体形式表达。用6M尿素溶解包涵体，在变性条件下使用6his—binding亲和层析纯化重组蛋白，获得的变性纯化蛋白采用透析方法通过逐步降低尿素浓度进行复性，在尿素浓度为1M时改用PBS透析，以去除尿素。
3.CsCatL重组蛋白的酶学特性和功能研究
以特异荧光合成肽Z—Phe—Arg—MCA和Z—Arg—Arg—MCA为底物，测定rCsCatL—mature的肽水解活性。通过荧光酶标仪测定，激发光360nm，测定465nm荧光波长的吸光度，依据AMC标准品制定的标准曲线，换算为产物浓度。计算酶动力学参数。并通过酶抑制剂进一步研究其酶学特性。通过对牛血清白蛋白、人IgG和血红蛋白水解作用来分析其生物学功能。
4.CsCatL为华支睾吸虫成虫分泌/排泄物的鉴定及在成虫、囊蚴和尾蚴的组织定位
将纯化的rCsCatL—promature免疫大鼠制备特异性抗体，对成虫分泌/排泄物进行Western blot分析。
RT—PCR检测CsCatL基因在囊蚴和尾蚴表达情况。
荧光免疫组化方法观察CsCatL在肝吸虫成虫、囊蚴和尾蚴阶段的组织定位，成虫和囊蚴制作成石蜡切片，尾蚴采用活体。一抗为anti—rCsCatL—promature的rat血清，阴性血清采用rat免疫前阴性血清。荧光显微镜下观察拍照。
5.CsCatL用于免疫学诊断效果的评价
分别以rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propetid作为抗原，通过ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清中特异IgG、IgG1、IgG2a、IgG4、IgE和IgA，并与日本血吸虫、肺吸虫、蛔虫、鞭虫和钩虫感染的人血清进行交叉反应测试，分析和评价三个重组蛋白的检测效果。
6.CsCatL免疫保护作用
rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide免疫大鼠，在免疫组大鼠血清中特异性IgG抗体效价高于1:102，400时，进行肝吸虫囊蚴感染。感染后第20天，每天收集粪便查虫卵，确定最早排虫卵时间；查到虫卵后，间隔1周，连续3次，收集粪便，按照司徒尔氏法进行虫卵计数；感染后第70天杀鼠，收集成虫计数。数据经统计学处理，P<0.05认为差异有统计学意义。
结果：
1.CsCatL基因的生物信息学分析
CsCatL基因全长1458bp，编码区为80-1191，编码371aa，在5’端和3’端都有非翻译区，是全长编码序列，GenBank中的登录号为DQ902583。编码371aa，aa1-18为分泌型信号肽，aa109-127为前体肽，aa128-371为成熟肽，属胞外分泌型蛋白。在前体肽具有cathepsin L的保守结构域ERFNIN、GNFD；成熟肽具有构成木瓜蛋白酶活性中心的3个保守催化位点Asn338、Cys177、His318；N端aa67-127位是保守木瓜蛋白酶前体肽抑制功能域；C端aa57-370属于木瓜蛋白酶家族；C端aa153-370 Peptidase C1功能域属木瓜蛋白酶家族中的L类；与日本血吸虫Cathepsin L1的氨基酸序列的一致可能性达53％，相似可能性达69％；预测属Cathepsin L样蛋白。前体蛋白的理论分子量是40.87kDa，pI是5.14。B细胞线性表位主要位于前体肽段内，并且序列的保守性明显低于酶活性区域，提示该功能域具有比成熟肽抗原更好的敏感性和特异性。在物种进化关系上，与日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝片吸虫和卫氏并殖吸虫源于同一祖先，与日本血吸虫亲缘关系最近。
2.CsCatL基因的克隆表达和重组蛋白的纯化和复性
成功构建原核pET—28a(+)重组表达质粒，重组质粒在原核E.coli BL21以包涵体形式表达，经变性纯化和复性后获得到较纯可溶性重组蛋白，rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptid浓度分别为780μg/ml、890μg/ml.200μg/ml。
3.CsCatL重组蛋白的酶学特性和功能研究
rCsCatL—mature在二硫苏糖醇存在时有水解活性，优先水解Z—Phe—Arg—AMC而不是Z—Arg—Arg—AMC，其活性100％被特异性半胱氨酸蛋白酶抑制因子E—64和硫醇封闭试剂IAA抑制，胰蛋白酶类抑制剂TPCK和丝氨酸蛋白酶类抑制剂PMSF分别抑制77％和13％酶活性，金属离子螫合剂EDTA没有抑制作用，显示CsCatL属于典型Cathepsin L类的半胱氨酸蛋白酶。
rCsCatL—mature在pH4.5-6.0酶活性较高，在pH5.5酶活性最高；28-42℃酶活性差别不是太大，42℃酶活性最高的；假设所有rCsCatL—maturer都具有酶活性，Km值是5.71×10-6 M，Vmax=0.6μM/min；一个酶活单位是2.95μg。
rCsCatL—mature在体外能降解BSA，不水解人IgG和血红蛋白。
Meb、Alb和Tem对rCsCatL—mature酶活性没有任何抑制作用，Fenb和Pra有15％左右轻度抑制作用。
4.CsCatL为华支睾吸虫成虫分泌/排泄物的鉴定及在成虫、囊蚴和尾蚴的组织定位
Western blot结果显示感染肝吸虫的阳性血清能识别rCsCatL—promature，而anti—rCsCatL—promature血清仅识别出ESPs一条带，该条带位置虽然不在CsCatL分子量附近，但接近理论成熟肽分子量，说明CsCatL是成虫的分泌/排泌物。
RT—PCR结果显示CsCatL基因在囊蚴和尾蚴阶段均有表达。
荧光免疫组化结果显示CsCatL在成虫定位于肠支，在囊蚴和尾蚴定位于合胞体即皮层细胞和皮层。
5.CsCatL用于免疫学诊断效果的评价
rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide检测肝吸虫病人血清特异IgG，交叉反应均很严重。rCsCatL—promature检测肝吸虫病人血清中特异IgG1敏感性高(24/24例)，但与血吸虫、肺吸虫、蛔、鞭、钩感染者均有交叉反应；rCsCatL—propeptid则检测血清中特异IgG4敏感性高(24/24例)，与血吸虫和肺吸虫感染者有交叉反应(主要是肺吸虫)。rCsCatL—propeptid检测101例不同感染度肝吸虫病人血清中特异IgG4的阳性检出率为90.1％，随感染度增加，阳性检出率上升，呈现出一定相关性；检测重度以上感染者阳性检出率高于轻度感染者(P<0.05)。
6.CsCatL免疫保护作用
rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide免疫大鼠后，血清中特异性IgG水平显著升高，至初次免疫后6w达高峰，以IgG1和IgG2为主；在血清特异性IgG效价高于1:102，400，进行肝吸虫囊蚴攻击感染，感染后第70天杀鼠。免疫组与对照组的EPG和成虫数经统计学处理无显著性差异，说明终宿主经CsCatL免疫后对囊蚴感染无免疫保护作用。
结论：
1.CsCatL属于半胱氨酸蛋白酶样家族的cathepsin L类蛋白酶；
2.CsCatL是来源于华支睾吸虫成虫肠道的的分泌/排泄物。
3.CsCatL的前体肽片段可作为检测肝吸虫病人血清中特异IgG4的候选诊断抗原。
4.CsCatL在成虫定位于肠支，在囊蚴和尾蚴定位于合胞体即皮层细胞和皮层。CsCatL在肝吸虫不同虫期的组织定位不同提示CsCatL在成虫和幼虫具有不同的生理功能。