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环境内分泌干扰物是一类存在于环境中的化学物质,可通过多种途径进入机体,直接或间接损害人类健康,因此成为当今环境卫生领域的研究热点。DEHP作为常见的环境内分泌干扰物,广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品及儿童玩具等方面,可以导致不孕不育、性早熟、子宫出血等疾病发生,已引起社会和学者的广泛关注。目的:本研究从组织形态学和分子生物学方面,系统地探讨DEHP暴露对青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴相关激素分泌水平,以及对相关基因和蛋白表达情况的影响,阐明DEHP暴露对青春期雌性大鼠的生殖内分泌干扰作用及其机制,揭示DEHP的雌性生殖毒性,为明确DEHP对人类生殖系统的潜在危害提供科学依据。方法:选择健康清洁级雌性Wistar大鼠48只为实验动物,21日龄,体重50~60g。随机分为4组,即对照组、低剂量组(250 mg/kg/d DEHP,1/120LD50)、中剂量组(500 mg/kg/d DEHP,1/60LD50)、高剂量组(1000 mg/kg/d DEHP,1/30LD50),每组12只。适应性饲养一周后,于每天清晨灌胃染毒1次,连续染毒4周。每日称重,记录饮食、饮水量,观察阴道开口情况并记录阴道开口时间。于动情间期处死大鼠,采血,离心后收集血清;取卵巢和子宫组织并称重,计算各脏器系数;HE染色法观察青春期雌性大鼠下丘脑、垂体、卵巢和子宫的病理组织变化;ELISA法检测大鼠下丘脑Gn RH激素分泌水平;放射免疫分析法检测大鼠血清中FSH、LH、E2、P和T分泌水平;实时荧光定量PCR法检测下丘脑-垂体-卵巢轴Gn RH、Kiss-1、GPR54等基因m RNA的表达情况;免疫组织化学染色法观察下丘脑-垂体-卵巢轴Gn RH、Kiss-1、GPR54等蛋白的定位情况;Western blot法测定下丘脑-垂体-卵巢轴相关蛋白的定量表达情况。结果:1.DEHP对青春期雌性大鼠的一般毒性及生殖毒性(1)DEHP染毒组大鼠活动减少,精神不振,行动迟缓,皮毛疏松无光泽,有脱毛现象,以高剂量组最为明显。(2)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠摄食量和体重显著增加(P<0.05);而饮水量显著减少(P<0.05)。(3)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠阴道开口时间显著提前(P<0.05);染毒组大鼠动情间期和动情周期的持续时间显著延长(P<0.05)。(4)DEHP染毒组部分大鼠卵巢充血、肿胀,体积增大;子宫体积增大,偶见水肿。(5)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠卵巢脏器系数显著升高(P<0.05)。2.青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴组织形态观察(1)DEHP染毒组与对照组青春期雌性大鼠下丘脑神经胶质细胞、神经元细胞以及神经纤维结构正常,神经元胞体呈多角形,胞核大而圆,居中,核仁大、圆、深染,胞质中充满深紫色小块或颗粒状尼氏体;神经胶质细胞的胞体和胞核均较大;少突胶质细胞的胞体较小,呈圆或卵圆形。(2)对照组和DEHP染毒组大鼠垂体远侧部均可见嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、嫌色细胞和毛细血管。(3)DEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞结构疏松、数量减少、轮廓模糊不清晰,细胞核大小不等;部分卵巢颗粒细胞出现核固缩、核碎裂等现象。(4)DEHP染毒组大鼠子宫内膜出现胞核假复层、上皮增生以及内皮纤维化;腔上皮细胞疏松、不整齐,细胞核大小不一;固有层腺体萎缩、数目减少。3.青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴激素水平测定(1)DEHP染毒组大鼠下丘脑Gn RH激素水平显著高于对照组大鼠(P<0.05),且随着染毒剂量增大而增高,存在剂量-反应关系。(2)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠血清FSH、LH、T激素水平显著降低(P<0.05),P激素水平显著升高(P<0.05),E2激素水平无显著差异(P>0.05)。4.青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴相关基因m RNA表达情况(1)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠下丘脑Gn RH和GPR54 m RNA表达水平无显著差异(P>0.05),Kiss-1 m RNA表达水平显著降低(P<0.05)。(2)低剂量组大鼠垂体Gn RHR m RNA表达水平明显低于对照组(P<0.05),高剂量组大鼠垂体Gn RHR m RNA表达水平显著高于其他各组(P<0.05);与对照组比较,DEHP染毒组大鼠垂体FSH及LH m RNA表达水平均显著降低(P<0.05)。(3)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠卵巢FSHR、LHR m RNA表达水平显著降低(P<0.05),而ERαm RNA表达水平则显著升高(P<0.05)。(4)与对照组比较,DEHP染毒组大鼠子宫Gn RHR m RNA及ERαm RNA表达水平均显著升高(P<0.05)。5.青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴相关蛋白表达情况(1)DEHP染毒组大鼠下丘脑组织中Gn RH、Kiss-1、GPR54蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)。(2)低剂量组大鼠垂体Gn RHR蛋白表达水平与对照组相比显著升高(P<0.05),中剂量组大鼠垂体Gn RHR蛋白表达水平与低剂量组相比显著下降(P<0.05),高剂量组大鼠垂体Gn RHR蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05);各染毒组大鼠垂体FSH、LH蛋白的表达水平明显低于对照组(P<0.05)。(3)与对照组相比,DEHP染毒组大鼠卵巢FSHR、ERα蛋白的表达水平显著下降(P<0.05);各组大鼠卵巢LHR蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(4)各组大鼠子宫Gn RHR蛋白的表达水平差异有统计学意义(P<0.05),低、中剂量组蛋白表达水平与对照组相比显著下降(P<0.05),高剂量组与其他各组相比显著升高(P<0.05)。各组大鼠子宫ERα蛋白的表达水平差异有统计学意义(P<0.05),与对照组和低剂量组相比,中剂量组蛋白表达水平显著下降(P<0.05);高剂量组与其他各组相比显著升高(P<0.05)。结论:1.DEHP暴露可使青春期雌性大鼠摄食量增加,体重增加,阴道开口时间缩短,动情周期延长。2.DEHP暴露可导致青春期雌性大鼠卵巢脏器系数增加,卵巢充血、肿胀,体积增大,卵巢颗粒细胞出现不同程度的损伤现象;DEHP可导致青春期雌性大鼠子宫体积增大、水肿,子宫内膜出现不同程度的损伤现象。提示卵巢和子宫可能是DEHP毒性作用的靶器官。3.DEHP暴露可使青春期雌性大鼠下丘脑Gn RH激素水平升高,且随着染毒剂量的增大而增高,存在剂量-反应关系。还可导致FSH、LH、T激素水平降低,P激素水平升高。提示DEHP可能对青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴具有内分泌干扰作用。4.DEHP暴露可以影响青春期雌性大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴Gn RH、Kiss-1、GPR54、Gn RHR、FSH、LH、FSHR、LHR及ERαm RNA和蛋白的表达。提示DEHP可能是通过影响这些基因的表达水平干扰下丘脑-垂体-卵巢轴的内分泌调节作用,从而影响性腺的发育和生殖功能。5.DEHP暴露可导致青春期雌性大鼠子宫Gn RHR m RNA和蛋白表达水平增加。提示DEHP可能是通过影响子宫Gn RHR的表达而影响其生殖功能。综上,DEHP对青春期雌性大鼠具有生殖毒性,可能通过干扰下丘脑-垂体-卵巢轴的内分泌调节作用,影响性激素的合成和分泌,损伤雌性动物的性腺和生殖内分泌功能,产生雌性生殖毒性。