论文部分内容阅读
神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是具有自我更新能力,并能增殖分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的一类细胞。神经干细胞的发现及分离培养是干细胞研究领域和神经生物科学研究领域的一个重要的里程碑。它们不仅存在于哺乳动物的发育阶段的神经系统中,而且还存在于成年哺乳类动物的神经系统中。这对以前神经系统发育成熟后不可能再生的理论提出了挑战,也为神经系统损伤修复及功能的重建带来了希望。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进行性神经退行性疾病,是脑神经细胞死亡而造成的神经性疾病。它主要的病理特征是大脑皮层和海马出现β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein,Aβ）聚集形成的老年斑（senile plaques,SP）,Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结（neurofibrillary tangle,NFT）以及大脑皮层和海马区神经细胞减少。高浓度的Aβ对神经元有神经毒性作用,Aβ的沉积是导致AD脑胆碱能神经元缺失的主要致病因素,也就是说Aβ的沉积是AD发病的中心环节。Aβ可引起氧化应激、Ca2+内流,进而损伤线粒体,导致神经细胞功能障碍,激活凋亡相关蛋白和因子,最终启动细胞的凋亡过程。另外,Aβ还可以通过引起脑内炎症反应和神经纤维缠结间接导致神经细胞的凋亡。葛根素（puerarin,Pue）是从豆科植物野葛的根部提取并分离出来的一种异黄酮类化合物。葛根素主要有扩张血管、改善微循环、抗氧化、修复内皮细胞损伤以及抑制脑细胞凋亡等药理作用。研究表明,葛根素对损伤的神经细胞有保护作用,能够抑制Aβ诱导的细胞凋亡。葛根素可治疗血管性痴呆,但未见治疗AD的临床研究报告。葛根素对神经干细胞的作用目前未见报道。本文以不同浓度的葛根素对Aβ25-35诱导的神经干细胞凋亡进行干预研究,探讨葛根素对神经干细胞是否具有保护作用,并对及其作用机制进行研究,为临床上将葛根素用于神经退行性疾病如AD等的防治提供实验依据和参考。本研究以15-16天胎鼠脑组织为实验材料,无血清培养技术体外分离培养神经干细胞。用免疫细胞化学方法对神经干细胞进行鉴定,用NSE、GFAP抗体鉴定分化的细胞。将经原代培养传代3次后的神经干细胞,将这些细胞培养孔分为三组:①不加Aβ25-35和葛根素的对照组;②只加Aβ25-35的处理组,即在培养孔中按20μmol/L的浓度加入凝聚态的Aβ25-35;③葛根素保护组,即同时加入20μmol/L凝聚态Aβ25-35和不同浓度的葛根素(分别按10-5,10-4,10-3mol/L浓度加入)。经48小时培养后,用倒置相差显微镜,Giemsa染色和DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测细胞的凋亡,并用RT-PCR技术检测细胞凋亡相关基因bcl-2和bax mRNA表达水平的变化。主要实验结果与结论如下:1.神经干细胞的分离、培养和鉴定:从孕15-16天的胎鼠脑组织中分离的细胞呈圆形,折光性好,培养6-7天后神经球边界较清晰,立体感强,可传代。第2代和第3代神经球,免疫细胞化学染色方法得到神经球内有较多Nestin阳性细胞。加入含10%胎牛血清的培养液诱导分化后,多数神经球贴壁生长且周围有突起长出,诱导分化5-6天后,形成较长突起相互交织的单个细胞;经免疫细胞化学染色,NSE、GFAP为阳性表达。说明分离培养传代后的细胞均表达Nestin,诱导分化后的细胞表达NSE、GFAP。表明实验分离培养的细胞具有自我更新和分化能力,具有神经干细胞的基本特性。表明我们体外分离培养得到的细胞是神经干细胞。2.细胞凋亡形态学观察:传代3次后的神经球,加入20μmol/L Aβ25-35继续培养48h,与对照组相比较,胞体变圆,突起数目减少,仅部分细胞贴壁,可见大量悬浮细胞;提示随着时间的延长20μmol/L Aβ25-35诱导细胞发生凋亡数目逐渐增多。10-4mol/L葛根素保护组,细胞突起的数目增加,多数细胞贴壁,仅见少量的悬浮细胞,提示10-4mol/L葛根素能够抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡,从而较好的保护细胞。Giemsa染色结果显示,Aβ25-35处理组,胞体小,呈深蓝色,细胞间的突触连接断裂;10-4mol/L葛根素保护组,细胞胞体变圆,染色较浅,细胞间有明显的突触连接。Aβ25-35对细胞具有损害作用,葛根素能够保护细胞免受损害。表明葛根素是通过抑制Aβ25-35诱导的细胞凋亡而起到对细胞的保护作用。3.凋亡相关基因bcl-2、bax mRNA水平的表达变化:RT-PCR结果显示,对照组细胞中的bcl-2、bax均无表达;Aβ25-35组细胞凋亡基因bax的表达较强,而抑制凋亡基因bcl-2的表达很弱;葛根素保护组细胞bcl-2、bax均有表达,而且发现10-4mol/L葛根素保护组细胞bcl-2表达量最大,而bax的表达强度和bcl-2相当。表明Aβ25-35在体外能够抑制神经干细胞的增殖,促进细胞凋亡,使凋亡基因bax mRNA的表达上调。说明葛根素具有拮抗Aβ25-35对神经干细胞的促凋亡作用,而这种拮抗作用是通过上调抑凋亡基因bcl-2 mRNA的表达来实现的。