[目的]肝脏是人体内为数不多的具有强大再生能力的器官,得益于其强大的再生能力,现阶段众多严重及晚期肝病最常用且有效的治疗手段是肝切除和肝移植。而肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic ischemia and reperfusion injury,HIRI）是上述手术治疗过程中不可避免的并发症,HIRI严重程度极大的阻碍了肝切除及肝移植手术的治疗效果,因此如何减轻HIRI至关重要。肝窦是一种特殊的毛细血管网,是肝血流与肝实质细胞之间交换物质的重要场所。肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells,LSECs）是肝脏内构成肝窦的主要细胞群,是机体内唯一缺乏基底膜并含有窗孔结构的特殊内皮细胞。生理状态下,LSECs一方面可以维持肝内血流动力学的稳定,另一方面还可以根据微环境的变化通过旁分泌途径调节周围细胞如肝星状细胞和肝细胞等,同时还可以通过其受体介导的内吞作用清除微环境中的血液废物,净化肝窦微环境。正是由于LSECs的结构和位置的特殊,使其在维持正常的肝脏功能中扮演着重要角色,并成为肝实质的重要防御屏障。也正因如此,当发生HIRI时,LSECs也是最先感知到损伤刺激的肝内细胞。因此如何减轻LSECs所受损伤对肝脏损伤修复十分重要。内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）被广泛定义为血管内皮细胞的前体细胞,具有干细胞的特性,能够分化为成熟的内皮细胞。众多的研究证明,EPC是血管网络重建中的强效再生细胞,在再生医学领域中扮演着重要角色。目前主要将EPC分为两类,早期内皮祖细胞（也称骨髓血管生成细胞）和晚期内皮祖细胞（也称内皮集落形成细胞）。EPC促进血管再生主要通过两种途径:其一、EPC具有增殖及分化潜能,能迁移至损伤处,分化为成熟的内皮细胞,促进血管生成;其二、EPC不直接分化为成熟的内皮细胞,而是通过旁分泌途径激活成熟的内皮细胞来促进血管形成。众多的研究表明,当肝脏损伤时,EPC会被募集至肝脏,协助修复肝脏损伤。并且我们先前的研究证明了血红素氧合酶-1（Heme Oxygenase-1,HO-1）能够动员EPC从骨髓中释放至外周血中,并向肝脏内迁移促进肝内、外胆管周围血管丛的修复。另有众多研究表明,EPC能够通过旁分泌途径刺激LSECs并促进肝脏血管再生。近年来,随着对外泌体的火热研究,内皮祖细胞来源的外泌体（endothelial progenitor cell-derived exosomes,EPC-exos）走进了广大研究者的视野,其内包含着脂质、蛋白、RNA等多种物质,能够作为细胞间物质和信号通讯的载体,在功能上可完美地平替EPC。众多研究指出EPC-exos能够促进多种内皮细胞的增殖及新生血管的形成,在心脏疾病、肾脏疾病、糖尿病、骨骼疾病和组织/器官损伤等多种疾病中发挥着显著的治疗效果。LSECs作为机体内一种特殊的内皮细胞,既然EPC能够通过旁分泌途径调节LSECs,那么EPC是否可以通过分泌外泌体修复损伤的LSECs?为此,本研究以LSECs为靶细胞,建立LSECs缺氧复氧损伤模型,探究EPC-exos对LSECs缺氧复氧损伤后的作用。[方法]1.骨髓来源的内皮祖细胞（Bone marrow-derived endothelial progenitor cells,BM-EPCs）的分离、培养与鉴定:应用梯度密度离心的方法分离EPC,用EGM-2MV培养基对其进行诱导分化培养,并选取培养至2-3代的EPC进行免疫荧光、流式细胞术、血管形成实验和乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素摄取等鉴定。2.EPC-exos的提取与鉴定:收集培养EPC上清液,通过外泌体提取试剂盒提取外泌体,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测所提取外泌体浓度,透射电镜下观察EPC-exos的形态及直径等,Western Blotting检测EPC-exos是否表达外泌体标记蛋白CD9、CD63和CD81。3.EPC与LSECs非接触共培养:利用Transwell小室,将EPC与LSECs进行非接触共培养48小时,随后对LSECs进行EDU染色检测其增殖情况。4.实验分组:将LSECs随机分为空白对照组（Control组,细胞不进行任何干预）、缺氧复氧损伤组（Hypoxia-reoxygenation injury group,H-R 组）、外泌体组（EPC-exos组,细胞缺氧复氧损伤全程给予合适剂量EPC-exos）、血管内皮细胞生长因子受体 2 抑制剂组（Vascular endothelial cell growth factor receptor 2 inhibitor group,在细胞缺氧复氧损伤全程同时给予合适剂量EPC-exos和血管内皮细胞生长因子受体2抑制剂ZM323881 hydrochloride,EPC-exos+ZM组）5.模型建立:当细胞汇合度到达90%时,空白对照组放于常氧培养箱中培养。剩余分组更换无血清、低糖培养基,将细胞放至37℃,含95%N2及5%CO2混合气体的三气培养箱中进行缺氧培养12小时,然后再放回37℃,空气体积为95%、CO2体积分数为5%的混合气体培养箱中进行复氧24小时。6.EPC-exos染色示踪:使用膜染色剂将EPC-exos染色后与LSECs共培养,荧光显微镜下观察LSECs能否摄取EPC-exos。7.CCK-8检测细胞活性:使用CCK-8细胞活性检测试剂盒,检测不同浓度EPC-exos对LSECs细胞活力的影响,选取最佳EPC-exos浓度进行后续实验。8.EDU染色检测细胞增殖情况:根据EDU细胞增殖检测试剂盒说明书检测各组LSECs的增殖情况。9.流式细胞术检测细胞增殖周期及凋亡的情况:实验模型建立完成后,收取全部细胞（包含细胞培养液中的飘浮细胞）分别加入周期和凋亡的检测试剂,通过流式细胞仪对LSECs进行检测。10.扫描电镜观察各组LSECs窗孔结构的改变。11.蛋白质印迹法（Western blot）及酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay;Elisa）检测相关蛋白分子的表达:Western blot检测周期蛋白 CyclinDl,凋亡蛋白 Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase3 和 LSECs 增殖及表型相关蛋白分子的表达。Elisa检测VEGF、IL-6、TNF-α、TGF-β、ET-1等细胞因子的表达。[结果]1.分离的BM-EPC经免疫荧光、流式细胞术和乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素摄取等鉴定证实,符合EPC的一般特征;EPC-exos电镜下成典型的“杯托”状,Western blot结果显示所提取外泌体有清晰的CD9、CD63、CD81条带;原代培养的LSECs扫描电镜下有典型的窗孔结构,vWF、LYVE-1免疫荧光阳性。2.EDU染色结果显示,EPC与LSECs共培养后能够明显促进LSECs增殖。3.荧光显微镜下可观察到LSECs能够摄取EPC-exos进入胞质内,为后续的研究奠定了基础。4.CCK-8检测细胞活性结果显示EPC-exos能够促进LSECs细胞增殖活力,并且此种促进作用与EPC-exos剂量成正相关。5.LSECs扫描电镜结果:H-R组相较于Control组细胞窗孔结构的数量明显减少,EPC-exos组相较于H-R组细胞窗孔结构数量明显增加,而EPC-exos+ZM组相比于EPC-exos组细胞窗孔结构数量又明显减少。6.EDU染色结果:H-R组相比于Control组LSECs增殖明显减少,EPC-exos组相比于H-R组LSECs增殖显著增加,而EPC-exos+ZM组相比于EPC-exos组LSECs增殖又明显减少。7.流式细胞术结果:在细胞凋亡方面,H-R组相比于Control组LSECs凋亡增加,EPC-exos组相比于H-R组LSECs凋亡明显减少,而EPC-exos+ZM组相比于EPC-exos组LSECs凋亡增加。然而在细胞周期上,与Control组相比,HR组中进入S期的LSECs数目明显减少;EPC-exos组与HR组相比,EPC-exos组中进入S期的LSECs数目明显增多;而EPC-exos+ZM组相比于EPC-exos组进入S期的LSECs数目明显减少。8.ELISA检测结果显示,LSECs在HR后,IL-6、TGF-β、ET-1、TNF-α 的表达增加,VEGF的表达亦增加;而相比于H-R组,EPC-exos组中的IL-6、TGF-β、ET-1、TNF-α的表达减少,而VEGF的表达增加。9.Western blot检测结果:H-R组相比于Control组LSECs内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase3表达增加,而Bcl-2及周期蛋白CyclinD1表达减少,并且VEGFR2-Id1信号通路相关蛋白的表达量减少;EPC-exos组相比于H-R组LSECs内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase3表达减少,而Bcl-2及周期蛋白CyclinD1表达增加,并且VEGFR2-Id1信号通路相关蛋白的表达量增加,而EPC-exos+ZM组相比于EPC-exos组LSECs内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase3表达增加,而Bcl-2及周期蛋白CyclinD1表达减少,并且VEGFR2-Id1信号通路相关蛋白的表达量减少。[结论]1.使用梯度密度离心法联合EGM-2MV培养基诱导分化可以获得大量且状态良好的BM-EPC,为后续实验提供稳定的细胞来源。收集细胞培养上清液,使用外泌体提取试剂盒,可成功地从EPC培养液中提取外泌体。2.EPC可以通过旁分泌的方式调节LSECs.3.LSECs缺氧复氧损伤后,EPC-exos可以保护LSECs的窗孔结构,促进LSECs增殖并抑制其凋亡。4.EPC-exos可能通过VEGF-VEGFR2-Id1信号轴调节LSECs对低氧环境的适应,从而减轻LSECs缺氧复氧损伤,起到保护LSECs的作用。