大脑是生物体内结构和功能最复杂的器官,由数以万亿计神经元与非神经元形成的神经系统网络组成,调控人的行为、感觉等生理活动。神经元一般不能再生,随着老龄化与外界环境改变,大脑和脊髓的相关神经元逐渐退化,导致神经功能障碍以及神经退行性疾病发生。近年来,神经退行性疾病患病与死亡率节节攀升,因此,探寻神经退行性疾病的发病机制与治疗方案,具有非常重要的意义。在成人神经系统中,促进神经轴突、树突和突触的再生是一种治疗神经退行性疾病十分理想的方法,但不幸的是,这种治疗策略至今尚未成功实现。神经营养素是一类诱导神经元存活、生长和功能化的蛋白,尽管前景看好,但作为治疗药物神经营养素却存在药理特性不够理想、血清稳定性和口服生物利用率较低、穿透中枢神经系统能力有限等问题,严重制约了其疗效。近年来,研究者发现一些天然小分子能够有效促进神经元生长,引起了广泛关注。与蛋白类药物相比,小分子具有更佳的组织穿透能力、稳定性以及药代动力学特征,显示出了良好的临床应用前景。然而,现有研究主要集中在天然产物提取、合成及其对神经元生长促进作用表征等方面,其对神经元结构和功能的保护、修复及作用机制尚不明确,大量研究工作亟需开展,研究方法与手段尚面临一些重要挑战。首先,体内神经细胞处于一个复杂而动态平衡的三维微环境中,传统二维培养模式无法重现体内微环境,导致体外实验结果难以反映体内真实情况。近年来,微流控芯片技术在细胞培养、微环境构建及时空调控等方面体现出了显著优势,为神经科学研究提供了新的思路。其次,神经活动中信号传递依赖于突触内神经递质释放,然而对于中枢神经元不到50 nm突触间隙内神经递质释放的实时监测,至今尚未实现。在这方面,纳米电极电化学方法具有时空分辨率高、灵敏度高等优势,有望在中枢神经元突触间隙实时监测方面取得突破。基于天然产物小分子在神经元保护及修复方面的前景与挑战,结合微流控芯片与纳米电化学探针在神经元微环境构建以及化学突触功能监测中的独特优势,论文开展了以下工作:1.发展了一种新型三维（3D）水凝胶浓度梯度微流控芯片,研究了3D微环境中天然产物（三种环烯醚萜苷类化合物）浓度梯度对神经元轴突的导向和定向修复作用。通过COMSOL有限元软件模拟和荧光染色表征,设计的3D水凝胶微流控芯片能形成稳定可控的分子浓度梯度。将原代多巴胺能（DA）神经元培养在3D水凝胶芯片中,发现神经元轴突沿药物浓度梯度方向定向生长,表明选取的天然产物能有效促进神经元发育;采用神经毒素6-OHDA处理多巴胺能（DA）神经元,构建帕金森（PD）模型,损伤后的神经元轴突明显退化,但在天然产物浓度梯度诱导下,损伤的神经元重新极化且极化方向与药物浓度增加的方向一致。这为今后在体外构建神经发育生理微环境提供了一种定量可控的平台,可望为神经退行性疾病的治疗方案优化以及药物筛选提供新思路。2.为了研究天然产物哈巴苷（一种环烯醚萜苷类化合物）对DA神经元突触功能的调控作用,我们制备了尖端直径50-200 nm的碳纤维纳米电极,插入原代DA神经元突触间隙内,首次实现了中枢神经元突触间隙内部神经递质释放的实时探测。结果表明:天然产物哈巴苷能有效提高DA神经元递质释放量,增加胞吐事件频率;DA神经元经神经毒素6-OHDA损伤后,神经递质释放功能急剧下降,而哈巴苷预处理的神经元能有效抗衡6-OHDA损伤反应,维持突触囊泡正常释放功能。为了进一步研究哈巴苷促进突触释放功能的内在机制,我们通过荧光探针和免疫荧光染色对胞内ROS的水平,α-突触核蛋白（α-synuclein）和磷酸化α-synuclein表达水平进行定量研究。结果证实哈巴苷能通过减少细胞内ROS水平抑制胞内α-synuclein单体磷酸化过程,从而增强突触释放功能。这项工作定量研究了天然产物小分子对中枢神经元突触功能的促进作用及内在机制,为基于抗炎性或抗氧化小分子的PD等其他神经退行性疾病的预防与治疗方案提供了重要的新思路。3.神经炎症是诱导多种神经退行性疾病的始发因素,而小胶质细胞作为中枢神经系统的首要免疫细胞,其对外界环境刺激非常敏感,在受到各种损伤（如炎症、感染和外伤等）刺激时,小胶质细胞被激活,产生大量ROS/RNS释放到胞外,从而造成神经元损伤。因此,控制小胶质细胞内活性氧水平将是一种预防神经退行性疾病的有效手段。为了进一步研究天然产物小分子对神经元损伤的保护作用,我们在神经元-小胶质细胞共培养体系中,利用炎性因子LPS与IFN-γ刺激小胶质细胞产生炎症反应,采用单根纳米线电极实时监测小胶质细胞内活性氧水平,同时表征DA神经元的胞吐功能。结果表明,小胶质细胞过度激活后,引起胞内活性氧显著上升,从而导致共培养体系中DA神经元活性下降以及α-synuclein磷酸化与硝基化;天然产物哈巴苷能有效抑制小胶质细胞的过度激活,降低小胶质细胞胞内ROS水平,避免α-synuclein磷酸化与硝基化,从而维持神经元神经递质胞吐释放功能。这些结果进一步揭示了抗炎性或抗氧化小分子保护神经元的作用机制。