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目的:氧化低密度脂蛋白等多种致病因素均可造成血管内皮损伤,受损内皮细胞释放趋化粘附分子促进单核细胞迁移至内皮下层成为巨噬细胞,巨噬细胞吞噬脂质后成为泡沫细胞,并进一步形成粥样斑块;其中M1型巨噬细胞又可释放炎症因子而损伤内皮细胞,内皮细胞损伤与巨噬细胞浸润形成恶性循环,加重动脉管壁病变及斑块的不稳定性。因此内皮细胞损伤与单核/巨噬细胞的相互作用对动脉粥样硬化斑块形成及增加斑块不稳定性具有重要意义。本研究采用离体实验观察通心络及人参皂苷Rb1对受损内皮细胞与单核细胞粘附及M1型巨噬细胞诱导内皮细胞凋亡的干预作用,为通心络临床防治动脉粥样硬化提供实验支撑。方法:本研究分为以下两部分:1通心络、人参皂苷Rb1对受损内皮细胞与单核细胞的粘附作用的影响实验分为正常对照组(Control)、模型组(Model)、通心络组(TXL)、人参皂苷Rb1组(Rb1),采用ox-LDL损伤HUVECs造成内皮细胞损伤模型并给予通心络和人参皂苷Rb1进行干预,检测各组内皮细胞生存活性、线粒体膜电位、细胞内钙离子变化及LOX-1/NF-κB信号通路相关蛋白的表达,以观察通心络和人参皂苷Rb1对ox-LDL损伤的内皮细胞的影响。采用共培养的方式观察各组内皮细胞与单核细胞的粘附,检测内皮细胞培养上清中趋化粘附分子的表达及单核细胞上相应受体的表达,以观察通心络和人参皂苷Rb1对受损内皮细胞与单核细胞粘附的影响。2通心络、人参皂苷Rb1对M1型巨噬细胞诱导内皮细胞凋亡的影响实验分为正常对照组(Control)、PMA对照组(PMA)、M2组、M1组、TXL组、Rb1组。采用PMA分别联合IL-4、LPS建立巨噬细胞极化模型并给予通心络和人参皂苷Rb1进行干预,检测细胞培养上清中M1和M2型巨噬细胞标志分子的水平及Notch信号通路相关蛋白的表达,以观察通心络和人参皂苷Rb1对巨噬细胞向M1型极化的影响。采用共培养的方式观察各组内皮细胞的凋亡过程及凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2的表达,以观察通心络和人参皂苷Rb1对M1型巨噬细胞诱导内皮细胞凋亡的影响。结果:1受损内皮细胞与单核细胞的粘附作用及通络干预研究1.1通心络和人参皂苷Rb1对ox-LDL损伤的内皮细胞的影响1.1.1通心络和人参皂苷Rb1提高ox-LDL损伤的内皮细胞的生存活性与正常对照组比较,ox-LDL可显著降低内皮细胞生存活性,通心络(TXL)、人参皂苷Rb1(Rb1)可提高ox-LDL损伤的内皮细胞的生存活性。1.1.2通心络和人参皂苷Rb1抑制ox-LDL引起的线粒体膜电位降低采用活细胞成像系统动态观察内皮细胞线粒体膜电位变化,绿色荧光标记线粒体,红色荧光标记线粒体膜上电势较高位置。正常对照组红色荧光持续存在,模型组红色荧光较快减弱消失,TXL和Rb1组红色荧光减弱发生较晚、程度较轻。表示TXL和Rb1可延缓并减轻ox-LDL引起的线粒体膜电位下降。1.1.3通心络和人参皂苷Rb1抑制ox-LDL引起的钙离子内流采用活细胞成像系统动态观察内皮细胞钙离子变化,绿色荧光标记钙离子。正常对照组绿色荧光持续存在于细胞周边部位,细胞内绿色荧光分布较少,模型组细胞内绿色荧光分布较广、程度较强,TXL和Rb1组细胞内绿色荧光分布明显比模型组少,与正常对照组分布相似。表示通络干预能够抑制ox-LDL引起的内皮细胞钙离子内流。1.1.4通心络和人参皂苷Rb1抑制LOX-1表达及NF-κB信号通路活化Western blot结果显示,与正常对照组比较,模型组HUVEC细胞LOX-1、p38MAPK、p IκBα、NF-κBp65、p NF-κBp65蛋白表达增多,IκBα蛋白表达减少;与模型组比较,TXL和Rb1组HUVEC细胞LOX-1、p38MAPK、p IκBα、NF-κBp65、p NF-κBp65蛋白的表达减少,IκBα蛋白表达增加。表示ox-LDL能促进内皮细胞LOX-1的表达及NF-κB信号通路的活化,TXL和Rb1能够抑制ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1的表达,减少IκBα的降解并抑制NF-κB信号通路的活化。细胞免疫荧光方法观察NF-κBp65核转位的结果也表明TXL和Rb1能够抑制ox-LDL引起的NF-κB信号通路活化。1.2通心络和人参皂苷Rb1对受损内皮细胞与单核细胞粘附作用的影响1.2.1通心络和人参皂苷Rb1抑制受损内皮细胞与单核细胞的粘附采用共培养及活细胞染色的方法观察内皮细胞与单核细胞的粘附,用hoechst-33342细胞核蓝色染料对单核细胞进行活细胞染色。结果显示,与正常对照组比较,模型组粘附于内皮细胞的单核细胞数量明显增多,与模型组比较,TXL和Rb1组粘附于内皮细胞的单核细胞数量明显减少。表明TXL和Rb1能抑制受损内皮细胞与单核细胞的粘附。1.2.2通心络和人参皂苷Rb1降低受损内皮细胞培养上清中趋化粘附分子的水平ELISA结果显示,与正常对照组比较,模型组内皮细胞培养上清中MCP-1、s ICAM-1、s VCAM-1的水平升高,与模型组比较,TXL和Rb1组内皮细胞培养上清中MCP-1、s ICAM-1、s VCAM-1的水平显著降低。表示TXL和Rb1能够抑制ox-LDL引起的内皮细胞趋化粘附分子的表达。1.2.3通心络和人参皂苷Rb1抑制内皮细胞条件培养基培养的单核细胞趋化粘附分子受体的表达qRT-PCR结果显示,与正常对照组比较,模型组THP-1细胞CCR2、Mac-1、VLA4 m RNA表达升高,与模型组比较,TXL和Rb1组THP-1细胞CCR2、Mac-1、VLA4 m RNA表达降低。Western blot结果显示,与正常对照组比较,模型组THP-1细胞CCR2、Mac-1、VLA4蛋白表达升高;与模型组比较,TXL和Rb1组THP-1细胞CCR2、Mac-1、VLA4蛋白表达降低。以上结果表明,TXL和Rb1能够抑制受损内皮细胞条件培养基培养的CCR2、Mac-1、VLA4的表达。2 M1型巨噬细胞对内皮细胞凋亡的影响及通络干预研究2.1通心络和人参皂苷Rb1对巨噬细胞向M1型极化的影响2.1.1通心络和人参皂苷Rb1抑制M1型巨噬细胞标志分子的表达与正常对照组比较,PMA组IL-10、IL-6、TNF-α的水平无统计学差异,说明实验浓度的PMA对巨噬细胞极化表型没有影响。与正常对照组比较,M2组IL-10水平升高,IL-6、TNF-α的水平无统计学差异;与正常对照组和M2组比较,M1组细胞培养上清中IL-10水平明显降低,IL-6、TNF-α水平明显升高,说明M2和M1型巨噬细胞模型建立成功。与M1组比较,TXL和Rb1组细胞培养上清中IL-10的水平升高,IL-6、TNF-α的水平下降,说明TXL和Rb1可以抑制LPS诱导的巨噬细胞向M1型极化。2.1.2通心络和人参皂苷Rb1抑制Notch信号通路活化Western blot结果显示,正常对照组与PMA组比较,Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表达无统计学差异,表明实验浓度的PMA没有对Notch信号通路产生影响。与正常对照组和M2组比较,M1组Notch-1蛋白表达无统计学差异,active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表达明显升高;与M1组比较,TXL和Rb1组active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表达显著降低。以上结果表明,TXL和Rb1可以抑制LPS诱导的巨噬细胞Notch信号通路的活化。2.2通心络和人参皂苷Rb1对M1型巨噬细胞条件培养基诱导内皮细胞凋亡的影响2.2.1通心络和人参皂苷Rb1抑制M1型巨噬细胞诱导的内皮细胞凋亡采用共培养方式以活细胞成像系统动态观察各组内皮细胞的凋亡过程。结果显示,正常对照组HUVEC细胞核形态规整,边缘清晰,荧光强度弥散均一,可见细胞分裂增殖;PMA组和M2组HUVEC细胞核观察初期与正常对照组无明显差别,观察后期可见细胞核固缩碎裂;M1组HUVEC细胞核较早出现浓染、固缩、边缘化,细胞核体积缩小,核碎裂,产生凋亡小体。TXL组和Rb1组HUVEC细胞核形态较M1组规整,边缘较清晰,核浓染、固缩、边缘化等现象发生较晚,程度较轻,并可见细胞分裂增殖。流式细胞仪检测结果显示,正常对照组与PMA组、M2组比较,内皮细胞凋亡率无统计学差异;与正常对照组比较,M1组内皮细胞凋亡率显著提高;与M1组比较,TXL和Rb1组内皮细胞凋亡率显著降低。2.2.2通心络和人参皂苷Rb1抑制M1型巨噬细胞诱导的内皮细胞凋亡蛋白的表达Western blot结果显示,正常对照组与PMA组、M2组比较,凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2的表达无统计学差异;与正常对照组和M2组比较,M1组caspase3、bax的蛋白表达升高,bcl-2的蛋白表达降低;与M1组比较,TXL和Rb1组caspase3、bax的蛋白表达降低,bcl-2的蛋白表达升高。结论:1通心络和人参皂苷Rb1可以抑制ox-LDL引起的内皮细胞LOX-1/NF-κB信号通路的活化,部分阻止线粒体膜电位下降和钙离子内流,起到改善受损内皮细胞功能,减少趋化、粘附分子表达的作用。并进一步减少由于内皮细胞损伤引起的单核细胞粘附及单核细胞趋化粘附分子受体的表达。2通心络和人参皂苷Rb1可以抑制LPS诱导的巨噬细胞Notch信号通路活化,部分阻止巨噬细胞向M1型极化,减少炎症因子表达,减轻M1型巨噬细胞引起的内皮细胞凋亡。3通心络和人参皂苷Rb1可以通过直接保护受损内皮细胞与抑制巨噬细胞向M1型极化而间接抑制单核细胞向受损血管内皮的趋化粘附及内皮细胞的凋亡,为通心络临床防治动脉粥样硬化提供了佐证。4人参皂苷Rb1作为通心络的成分之一,在本实验中具有与通心络相近的作用,提示人参皂苷Rb1可能是通心络发挥作用的物质基础之一。人参皂苷Rb1和通心络发挥作用的具体机制以及人参皂苷Rb1是否具有与通心络相近的其他作用需要进一步研究。