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禽白色念珠菌病(Candidiasis)是由念珠菌属的白假丝酵母菌(Monilia albican或Candida albicans)引起的条件性真菌病,引起雏禽高死亡率、生长迟缓、疫苗免疫效果低下;种禽生产性能降低,淘汰率升高。我们对禽白色念珠菌病的流行情况与危害、禽白色念珠菌病病原生物学特性、分子生物学鉴定、毒力及致病性、药物敏感性分析、疫苗免疫、预防与治疗方面进行研究,并针对临床分离的致使养殖珍禽和家禽发病的10株禽白色念珠菌病原进行试验研究,为揭示禽白色念珠菌病的病原特性及发病规律,为禽白色念珠菌病的快速诊断、疫苗研制、筛选高疗效中药,为养殖生产中禽白色念珠菌病的防控技术应用提供实验依据。本研究从珠三角地区多个特禽养殖场及家禽养殖场进行禽白色念珠菌病调查,发现养殖禽群普遍存在有白色念珠菌感染和发病的现象。在潮湿通风不良、不卫生的环境条件、营养不平衡、饲养管理不良以及存在着使禽体衰弱的应激时,容易促使白色念珠菌病暴发,发病率往往超过10%,禽白色念珠菌阳性率32%以上。对于2周龄左右雏禽,发生白色念珠菌病己成为与白痢、大肠杆菌病、禽支原体病一样普遍频发,且常并发大肠杆菌和支原体而使病情长期存在难以根治。主要研究内容包括:
⑴对黄鸡、珍珠鸡、鹧鸪、雉鸡、贵妃鸡、鸽六种鹑鸡类禽临床症状表现为育雏期高死亡率、生长发育不良、羽毛粗乱、精神萎顿、大嗉囊、倒提流口水、消瘦、拉稀等症状的发病禽中分离获得10株菌,与质控菌ATCC64550(耐药菌株)和ATCC64548(敏感菌株)共12株白色念珠菌作为本研究试验菌株。经培养特性、生化试验及分子生物学鉴定,诊断临床分离的10株菌均为白色念珠菌。10株禽白色念珠菌在CHROMagar candida培养基上呈现翠绿色、圆型、隆起、光滑上菌落;能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖和甘露糖产酸产气;发酵半乳糖和蔗糖微产酸;不发酵糊精、菊糖、乳糖和棉子糖。明胶穿刺培养出现短绒毛状或树枝状侧枝,但不液化培养基。VITEK细菌全自动分析系统检测白色念珠菌阳性、ITS序列分析对比白色念珠菌相似率99.9%。
⑵用引物ITS2与ITS5从8株白色念珠菌菌株基因组中扩增出ITS1片段,经测序分析,8个菌株序列长度在241-242bp之间,基因高度保守,在129、155、172和185位点发生变异,经BLAST比较,与CGD(Candida Genome Database)中野生型菌株SC5314-ITS1序列同源性比较发现,SC5314-ITS1与3-YCX、4-PTS、5-PGG、6-GFH、7-GFJ、8-PTP同源性为100%,与1-PSB同源性为98%,与2-PSS同源性均为99%。采用Mega4.0软件进行聚类分析同样发现1-PSB菌株与其他菌株亲缘关系较远。针对白色念珠菌25SrRNA基因采用CA-INT-L和CA-INT-R引物进行PCR扩增条带,可以分成三种类型:10-PTX、ATCC64550、ATCC64548为A型;1-PSB、2-PSS、6-GFH、4-PTS、3-YCX、8-PTP为B型;5-PGG、9-RCP、7-GFJ为C型。根据R1引物RAPD基因的PCR扩增条带,10株禽白色念珠菌分布于A基因群,1-PSB、2-PSS、3-YCX、5-PGG、7-GFJ、8-PTP为A1基因型,4-PTS、6-GFH、9-RCP、10-PTX、12-ATCC64548为A2基因型,11-ATCC64550为B基因群。4株禽白色念珠菌的凝集素样ALS1基因测序发现序列和Candida Genome Database上SC5314菌株序列高度一致(87%~100%)。分子特性表明测试的禽白色念珠菌属于抗真菌药敏感的高致病性菌株。
⑶试验的禽白色念珠菌对哺乳类动物和禽类均有致病性。经腹腔接种小白鼠,能使80%小白鼠在接种后48h内死亡;耳静脉接种家兔,能使家兔72h内死亡。肝、肾、肺等主要器官组织细胞变性,弥漫性坏死,白色念珠菌孢子和菌丝浸润,被膜大量菌丝体覆盖。口服、皮下注射和静脉注射接种均使试验禽发病死亡,导致嗉囊粘膜增厚,粘膜覆盖豆腐渣样假膜和溃疡,病变可延伸至口腔、食道、腺胃和肌胃粘膜。
⑷CHROMagar candida显色培养基可直接作为禽病临床的初次分离与鉴定禽白色念珠菌,ITS基因PCR可快速诊断白色念珠菌病原,检测浓度低至700cell/mL。口服和皮下注射全菌体灭活疫苗,能在免疫后3~5周产生凝集价高达1:3200的抗体水平,随后迅速下降,7周后降至1:50或以下(阴性)。皮下注射免疫比口服免疫能产生更高的抗体水平,而且更能抵抗静脉攻毒。免疫后攻毒存活鸡抗体水平下降迅速,与禽病临床上白色念珠菌反复感染发病和持续感染相关。
⑸ROSCO抗真菌药敏片检测结果,10株禽白色念珠菌对所测试的药物,两性霉素B(AMPHO)、制霉菌素(NYST)、酮康唑(KETO)、咪康唑(MICO)、氟康唑(FLZ)和伊曲康唑(ITRA)均敏感。制霉菌素仍然是很有效的防治白色念珠菌病药物,但口服后不吸收而由粪便排出,鸟粪中高残留量对环境造成的影响。中草药对禽白色念珠菌有很好的抑菌作用,检测28种中草药单剂,其中黄岑、蛇床子、黄连和高梁姜的单剂乙醇浸泡液对ATCC64550(耐药菌株)、7-GFJ和3-YCX念珠菌的MIC均是6.25mg/mL;大黄、苦参、土槿皮、灯心草的MIC是12.5mg/mL。